王 霆 崔紅宙 王德彤 高 杰 郭書萍

慢性家族性良性天皰瘡，又名Hailey-Hailey病(Hailey-Hailey disease，HHD，OMIM 169600)，是以皮膚褶皺部位反復(fù)出現(xiàn)水皰、糜爛為主要特征的常染色體顯性遺傳性皮膚病[1]。組織病理上以基底層上方棘層松解形成裂隙和水皰為特征。本研究前期收集到典型的HHD 5家系，通過Sanger測序?qū)蚁党蓡T進行ATP2C1基因序列檢測，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究選取來自不同家系的12例患者，最小發(fā)病年齡21歲，最大69歲，先證者經(jīng)我科臨床及病理組織檢查，確診為HHD,患者皮損見圖1a～1e,家系圖見圖2a～2e?；颊吆炇鹬橥鈺⑹占∈焚Y料及外周血。同時選取13名表型正常的不同家系成員和100名健康對照，簽署知情同意書，該研究通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA 采集HHD家系中患者及家系內(nèi)表型正常者的外周靜脈血5 mL，存儲于2% EDTA抗凝管中，-80℃保存。使用QIA amp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德國)提取基因組DNA，同時以100名與該家系無親緣關(guān)系的健康個體作為對照。

1.2.2 PCR擴增 引物序列設(shè)計參考文獻[2]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s,64℃退火30s，72℃延伸50s，前12循環(huán)退火溫度每循環(huán)降0.5℃，以58℃為退火溫度24個循環(huán)，72℃延伸10min。

1.2.3 DNA測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交與上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司行Sanger測序，測序結(jié)果使用Chromas軟件解讀，并與人類基因組數(shù)據(jù)庫ATP2C1基因序列進行對比。

1a：家系1先證者腹股溝、陰囊紅斑基礎(chǔ)上糜爛、浸漬、裂隙；1b：家系2先證者腋下紅斑、浸漬；1c：家系3先證者腋下紅斑、浸漬；1d：家系4先證者腹股溝紅斑、浸漬；1e：家系5先證者雙側(cè)腹股溝、外陰彌漫潮紅色斑、糜爛、浸漬

圖1先證者臨床表現(xiàn)

2a～2e分別為家系1～5家系圖(標“↑”者為先證者；標“+”者為行ATP2C1基因突變檢測)

2 結(jié)果

家系1中3例患者在 ATP2C1基因第18號外顯子上發(fā)現(xiàn)錯義突變c.1738A>G(p.I580V)(圖3a)，使用Polyphen-2軟件進行蛋白功能預(yù)測，預(yù)測結(jié)果為possibly damaging (score=0.722)。在表型正常的3名家系成員中未發(fā)現(xiàn)該突變；家系2中2例患者在第25號外顯子上發(fā)現(xiàn)無義突變c.2416C>T(p.R806*)(圖3b)，2名表型正常的家系成員中未發(fā)現(xiàn)該突變。家系3中3例患者在第15號外顯子上發(fā)現(xiàn)錯義突變c.1250G>A(p.R417K)(圖3c)，使用Polyphen-2軟件進行蛋白功能預(yù)測，預(yù)測結(jié)果為benign(score=0.100)，同時家系內(nèi)2名表型正常的個體未發(fā)現(xiàn)該突變。這些突變在100名無親緣關(guān)系的正常人中均未發(fā)現(xiàn)。家系4、家系5 ATP2C1基因未發(fā)現(xiàn)突變。

3 討論

HHD由Hailey兄弟于1939年首次報道并因此得名。該病呈世界性分布，發(fā)病率約為1∶50000，男女發(fā)病率大致相同，約70%患者有家族史[1]。該病的臨床表現(xiàn)為皮膚褶皺部位反復(fù)出現(xiàn)水皰、糜爛，常伴不同程度瘙癢，夏重冬輕。目前尚無有效治療手段。

1995年，Richard等[2]利用微衛(wèi)星多態(tài)性標記對6個來自德國和意大利的家系行基因連鎖分析將HHD致病基因定位于3q21～q24。2000年，Sudbrak和Hu等[3,4]在3q21～q24區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)ATP2C1為HHD致病基因。ATP2C1基因包含28個外顯子，全長約107.46kb，編碼949個氨基酸。截至目前，已發(fā)現(xiàn)140余種突變，其中中國漢族人群突變已超過80種[5,6]，突變方式包括錯義突變、剪切位點突變、無義突變、移碼突變及其他方式突變，這些突變散在分布于各個外顯子，目前尚無明確的熱點突變。人類ATP2C1基因與小鼠SPLA基因和酵母PMR1基因同源[7]，均為編碼高爾基體介導(dǎo)的鈣泵[8]。該基因的最終翻譯產(chǎn)物為人高爾基體分泌途徑Ca2+/Mn2+ATP酶(hSPCA1)。hSPCA1蛋白在人體多個組織中均表達，其中在角質(zhì)形成細胞和腎臟內(nèi)高度表達。這種鈣泵可將胞漿內(nèi)鈣離子主動運輸至高爾基體內(nèi)，維持高爾基體內(nèi)高鈣離子濃度和胞漿內(nèi)低鈣濃度，使角質(zhì)形成細胞對胞外鈣離子濃度的變化反應(yīng)敏感[9]。

圖33a：ATP2C1基因第18號外顯子c.1738A>G；3b：ATP2C1基因第25號外顯子c.2416C>T；3c：ATP2C1基因第15號外顯子c.1250G>A

本研究中發(fā)現(xiàn)的c.1738A>G、c.2416C>T、c.1250G>A所編碼氨基酸分別位于跨膜片段4、5之間的胞質(zhì)區(qū)和跨膜片段7、8之間的腔道區(qū)，我們推測，當胞質(zhì)區(qū)和腔道區(qū)發(fā)生突變時，必然會影響hSPCA1結(jié)構(gòu)的改變，從而影響其在鈣離子或錳離子轉(zhuǎn)運和存儲功能，導(dǎo)致細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，無法維持高爾基體內(nèi)鈣離子濃度，使其對胞外鈣離子變化敏感性降低，從而導(dǎo)致其削弱某些重要蛋白質(zhì)的糖基化、水解、折疊及轉(zhuǎn)運過程，特別是橋粒糖蛋白、橋斑蛋白的磷酸化和肌動蛋白的合成障礙，最終破壞細胞間黏附[10]。關(guān)于家系4、5未發(fā)現(xiàn)ATP2C1基因未發(fā)現(xiàn)基因突變的原因分析如下：(1)常規(guī)PCR擴增、電泳和測序無法檢出ATP2C1基因大片段乃至于整個片段的缺失；(2)由于引物設(shè)計著重考慮外顯子區(qū)域而忽略影響剪切、mRNA穩(wěn)定性及蛋白翻譯的內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)及啟動子區(qū)域。

目前大量有關(guān)ATP2C1基因突變已陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)的c.1738A>G、c.2416C>T曾于2002年被Dobson-Stone等[10]報道，c.1250G>A曾于2012年在漢族人群中被Zhang等[11]報道。c.2416C>T則是在我國漢族種群首次被報道。對病例進行基因型-表型關(guān)聯(lián)性研究可以促進對基因診斷和精準醫(yī)療的發(fā)展，下一步我們準備收集更大的樣本量，完善中國漢族人群基因型數(shù)據(jù)庫；同時對基因型-表型關(guān)聯(lián)性研究可以更好地指導(dǎo)基因診斷，為HHD患者的精準治療提供理論基礎(chǔ)。