殷新光 徐龍生 吳一鳴 薛文英 徐英

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）是肝臟合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，其活化可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的失衡，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[1]。在慢性肝損傷中HSC要經(jīng)歷增殖與表型的轉(zhuǎn)變，由原來富含維生素A類物質(zhì)的靜止的表型“轉(zhuǎn)分化”為活化的肌纖維母細(xì)胞樣表型，即HSC發(fā)生活化[2]。在此過程中，多種信號通路參與，如 Wnt/p-catenin、Jagged/Notch 信號通路[3]。R-脊椎蛋白 2（roof plate-specific spondin-2，R-Spondin2）、多配體蛋白聚糖1（Syndecan-1）均是Wnt/p-catenin信號通路重要的調(diào)節(jié)分子[4-5]?；诖耍狙芯坎捎皿w外實驗研究的方法，探討R-pondin2、Syndecan-1在HSC活化中的作用及可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器 24只8～10周齡健康雄性昆明種小鼠（江蘇齊氏實驗動物中心），體重38～40g。兔多克隆α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（美國R&D公司）；小鼠R-Spondin2抗體、小鼠Syndecan-1抗體、小鼠重組R-Spondin2蛋白、小鼠重組Syndecan-1蛋白（美國Sigma公司）；第二抗體（武漢博士德生物科技有限公司）；DMEM、Trizol和 FBS（美國 Invitrogen公司）；RIPA裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、鏈霉蛋白酶E、Ⅳ型膠原酶、SYBR試劑、BSA、DAPI（武漢博士德生物科技有限公司）；離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、紫外分光光度計（上海儀電分析儀器廠）、電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗小鼠分組與HSC分離制備 將小鼠按隨機數(shù)字表法分為6組，每組4只，均在實驗室標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，自由攝取食物和水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖出小鼠肝臟，用鏈霉蛋白酶E和Ⅳ型膠原酶灌流小鼠肝臟，Nycodenz密度梯度離心分離并培養(yǎng)原代小鼠HSC。細(xì)胞計數(shù)法測細(xì)胞得率，錐蟲藍(lán)拒染法測細(xì)胞存活率（確保存活率＞90%）。H1組：HSC分離培養(yǎng) 1d；H2組：HSC 分離培養(yǎng) 3d；H3組：HSC 分離培養(yǎng)7d；R+S-組：HSC分離培養(yǎng)24h后，給予20 ng/ml R-Spondin 2刺激24h；R-S+組：HSC分離培養(yǎng)24h后，給予 20 ng/ml Syndecan-1刺激 24h；R-S-組：HSC分離培養(yǎng)48h，未予任何刺激。分離的HSC以1×105個/cm2接種于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)[6]。收集各組HSC進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 外源性R-Spondin2、Syndecan-1刺激 R+S-組、RS+組、R-S-組小鼠分離的 HSC HSC 以 1×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。對R+S-組HSC給予20 ng/ml重組R-Spondin2蛋白刺激24 h；對R-S+組HSC給予20 ng/ml重組Syndecan-1蛋白刺激24 h；R-S-組HSC僅分離培養(yǎng)48h。收集R+S-組、R-S+組、R-S-培養(yǎng)的HSC進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 各組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。RIPA裂解液提取各組HSC總蛋白，用紫外分光光度計測定蛋白質(zhì)濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，分別加入 R-Spondin2 抗體（1∶1 500）、Syndecan-1抗體（1∶1 000）和 α-SMA 抗體（1∶500），4℃孵育過夜。洗膜后加入第二抗體（1∶2 000），室溫孵育2h后采用電化學(xué)發(fā)光試劑檢測。以GAPDH為內(nèi)參照，凝膠掃描成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）對各條帶的灰度值進(jìn)行分析，檢測目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.4 H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法。PCR引物由上海齊合生物工程技術(shù)有限公司合成，見表1。Trizol法提取HSC總RNA，-80°C保存。紫外分光光度計測定260 nm和280 nm波長處的吸光度值，計算提取的總RNA濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。PCR 體系：SYBR 試劑 10μl，濃度 10μmol/L的上、下游引物各 0.5μl，樣品 cDNA 2μl，雙蒸水 7μl。PCR 條件：95℃ 4min；95℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72°C延伸5 min。用SDS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用比較Ct值（循環(huán)閾值）的方法分析結(jié)果，目的mRNA的相對表達(dá)水平由GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.5 H1、H2、H3組小鼠HSC活化狀態(tài)觀察 采用免疫熒光染色法。待H1組、H2組、H3組細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1%Triton X-100透膜15min；PBS再次沖洗，然后在室溫條件下用4%BSA封閉細(xì)胞30min；按1∶150的比例稀釋α-SMA、Desmin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育過夜；PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀釋二抗，37℃條件下放置1h；用PBS沖洗3次，每次10min，最后DAPI染細(xì)胞核并用顯微鏡拍照觀察HSC活化狀態(tài)。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察H1、H3組小鼠HSC活化狀態(tài)；（2）比較 H1、H2、H3組小鼠 HSC α-SMA 蛋白與 mRNA表達(dá)水平；（3）比較 H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2和Syndecan-1蛋白與mRNA表達(dá)水平；（4）比較R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR引物

2 結(jié)果

2.1 H1、H3組小鼠HSC活化狀態(tài)觀察結(jié)果 見圖1（插頁）。

由圖1可見，免疫熒光染色結(jié)果顯示H1組小鼠HSC α-SMA蛋白表達(dá)微弱，處于未活化狀態(tài)；H3組小鼠HSC，即HSC分離培養(yǎng)7d，α-SMA蛋白高度表達(dá)，具有肌細(xì)胞特征，有向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化趨勢，這說明HSC在體外培養(yǎng)時發(fā)生了從靜息到活化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

2.2 H1、H2、H3組小鼠 HSC α-SMA 蛋白與 mRNA 表達(dá)水平比較 見表2。

表2 H1、H2、H3組小鼠HSCα-SMA蛋白與mRNA表達(dá)水平比較

由表 2 可見，H1、H2、H3組小鼠 HSC α-SMA 蛋白與mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），H3組小鼠HSC α-SMA蛋白與mRNA表達(dá)水平＞H2組＞H1組。即隨著HSC的活化，α-SMA蛋白與mRNA的表達(dá)水平上調(diào)且呈時間依賴性地上升。

2.3 H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2 和 Syndecan-1蛋白與mRNA表達(dá)水平比較 見表3。

表 3 H1、H2、H3組 HSC R-Spondin2 和 Syndecan-1 蛋白與 mRNA表達(dá)水平比較

由表 3 可見，H1、H2、H3組小鼠 HSC R-Spondin2 和Syndecan-1蛋白與mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），H3組小鼠HSC R-Spondin2蛋白與mRNA表達(dá)水平＞H2組＞H1組，而H3組小鼠Syndecan-1蛋白與mRNA表達(dá)水平＜H2組＜H1組。即隨著HSC的活化，R-Spondin2的表達(dá)上調(diào)并呈時間依賴性地上升，Syndecan-1表達(dá)下調(diào)且呈時間依賴性地下降。

2.4 R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平比較 見表4。

表 4 R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC R-Spondin2、Syndecan-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平比較

由表4可見，R-S+組小鼠HSC R-Spondin2蛋白表達(dá)水平低于 R-S-組小鼠 HSC（P＜0.05）。R+S-組、R-S-組小鼠HSC Syndecan-1蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。R+S-組、R-S+組、R-S-組小鼠 HSC α-SMA蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），R+S-組小鼠 HSC α-SMA 蛋白表達(dá)水平＞R-S-組＞R-S+組。即Syndecan-1負(fù)向調(diào)控R-Spondin2的表達(dá)，介導(dǎo)HSC的活化。

3 討論

肝纖維化是由不同病因引起的慢性肝病發(fā)生、發(fā)展的必經(jīng)過程，對肝纖維化的預(yù)防和早期干預(yù)是穩(wěn)定病情、防止肝纖維化向肝硬化、肝癌發(fā)展的有效措施[7]。因此，深入研究肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展機制，對慢性肝病的防治具有重要意義。HSC是肝臟合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，其活化即發(fā)生肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[8]。本研究以分離培養(yǎng)的小鼠HSC為研究對象，運用Western blot、RT-PCR、免疫熒光等檢測方法探討HSC活化過程中的相關(guān)機制，對闡明或阻斷HSC的活化，防治肝纖維化的發(fā)生具有重要意義。

HSC的活化受眾多細(xì)胞因子的調(diào)控，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路影響HSC的活化，阻斷Wnt信號通路可抑制HSC的增殖、誘導(dǎo)其凋亡[3]。R-Spondin蛋白家族是Wnt信號通路的重要調(diào)控因子，包括4種成員：RSpondin1、2、3、4。其序列相似度為 40%～60%，且具有相似的結(jié)構(gòu)模式[9]。R-Spondin家族蛋白在消化道的組織分化、器官形成及疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，RSpondin1對小腸表皮細(xì)胞生長有重要影響，而且RSpondin1能誘導(dǎo)小腸干細(xì)胞，對放化療有保護(hù)作用[10-11]。R-Spondin2-LGR5信號對結(jié)腸癌有抑制作用[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，由R-Spondin2介導(dǎo)的信號通路能夠調(diào)控致命腸道腹瀉的易感性[13]。上述研究表明在消化道發(fā)育和疾病發(fā)生過程中，R-Spondin對調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移能力起著重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，隨著體外培養(yǎng)HSC時間的延長，α-SMA的表達(dá)水平呈時間依賴性地上升，且免疫熒光染色顯示HSC分離培養(yǎng)到第7天，α-SMA蛋白高度表達(dá)，具有肌細(xì)胞特征，向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化趨勢，HSC發(fā)生了從靜息到活化的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。在此過程中，RSpondin2的表達(dá)水平也隨時間延長而明顯上調(diào)。這提示R-Spondin2可能參與調(diào)控HSC的活化。

Sydecan-1屬細(xì)胞表面跨膜蛋白多糖，是膜表面黏附受體，屬于細(xì)胞間質(zhì)、質(zhì)膜的重要組成成分[14]。Sydecan-1以共價受體方式調(diào)節(jié)細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，參與組織器官發(fā)育、血管形成、組織再生等生理過程，它的表達(dá)受高度調(diào)節(jié)，具有細(xì)胞類型和發(fā)育階段特異性[15]。細(xì)胞利用整合素和Sydecan-1雙受體介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞分化類型，抑制腫瘤細(xì)胞生長[16]。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)HSC時間的延長，Sydecan-1蛋白與mRNA的表達(dá)呈時間依賴性地下降，Sydecan-1也可能參與調(diào)控HSC的活化。本研究結(jié)果還顯示，在HSC的活化過程中，R-Spondin2表達(dá)上調(diào)，而Syndecan-1表達(dá)下調(diào)。兩者是否存在于同一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，與HSC的活化是何種關(guān)系，尚未見文獻(xiàn)報道。本研究對分離的小鼠HSC分別給予R-Spondin2、Syndecan-1重組蛋白刺激，結(jié)果顯示，RSpondin2蛋白刺激24h，α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，而Syndecan-1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；給予重組Syndecan-1蛋白刺激24 h，R-Spondin2、α-SMA蛋白表達(dá)均發(fā)生下降。因而筆者推測，R-Spondin2和Syndecan-1共同參與HSC的活化，并且Syndecan-1負(fù)向調(diào)控R-Spondin2的表達(dá)，從而促使HSC發(fā)生活化。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示體外分離培養(yǎng)小鼠HSC，可使其發(fā)生活化，在此過程中，Syndecan-1表達(dá)下調(diào)，負(fù)向調(diào)控R-Spondin2表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)α-SMA表達(dá)增加促使HSC活化。這提示結(jié)合R-Spondin2、Syndecan-1兩者相互研究，或?qū)殛U明或阻斷HSC的活化，防治肝纖維化的發(fā)生提供實驗依據(jù)。