駱許靜 馬耀先 孫 楨 方曉瑞 申曉燕

肺癌是1種全世界范圍內常見的惡性腫瘤，它起源于支氣管黏膜及腺體，發(fā)病率極高，其發(fā)病率及死亡率高居惡性腫瘤之首，并且其發(fā)病率逐年升高[1]，2017年的研究數據表明，全國惡性腫瘤發(fā)病第1位的是肺癌，每年新發(fā)病例約73.3萬[2]。目前，傳統診斷有局限性[3]，不能檢測到循環(huán)血液中的癌細胞和其他器官中的微小轉移灶，許多患者因遠處器官和組織的轉移而復發(fā)，部分初期肺癌將會發(fā)展為晚期的肺癌，給患者帶來極大的痛苦。早發(fā)現、早診斷、早治療，提前控制病情是治療肺癌有效方法，但由于該疾病前期癥狀不明顯，亟需1種靈敏的診斷方法[4]。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是從原發(fā)腫瘤或者轉移灶上脫落后進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，CTC在腫瘤的研究中得到廣泛的應用[5]，CTC逐漸體現出多種癌癥診斷方面的價值[6]。研究顯示[7-8]， CTC檢測在肺癌中也表現較好的敏感性和特異性。本研通過CTC檢測與臨床相結合，探討CTC檢測對診斷肺癌疾病及其轉歸的臨床價值，以期CTC能夠在肺癌診斷、治療和預后評估中得到更廣泛的應用，為醫(yī)學界同仁提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

肺癌患者組：選取自2016年3月至2017年5月在我院就診的60例肺癌患者,其中男性26例,女性34例，平均年齡為62.2歲，38～80歲。納入標準：①經胸部CT掃描及其他組織病理學檢查確診為肺癌患者；②年齡在18～80歲；③入組前未接受任何抗腫瘤治療。非結核的肺良性疾病患者組：選取自2016年3月至2017年5月在我院就診的10例肺良性疾病患者，其中男性7例，女性3例，平均年齡為61.9歲，37～80歲。納入標準：①病理學檢查排除肺惡性腫瘤；②符合非腫瘤相關疾病臨床診斷標準；③有微生物學或組織學證據。另選取健康志愿者10例，男性6例，女性4例，平均年齡為53歲(28～69歲)。三組受試者在性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。所有受試者均簽署了知情同意書,經倫理委員會審查通過。根據胸部CT、B超和纖維支氣管鏡的臨床檢測結果，其中小細胞肺癌患者11例，非小細胞肺癌患者49例；依據第八版國家肺癌TNM分期標準，其中Ⅰ期10例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例、Ⅳ期12例。

1.2 方法

首先采集所有患者靜脈血7.5 ml，加入到ACD抗凝試管。加入6.5 ml磷酸鹽緩沖液混入其中，充分搖勻，以2000 rpm室溫離心15 min，離心3次。將富積到的細胞均勻涂在玻片上，使用抗體混合液(人鼠抗Pan-細胞角蛋白CK，生產廠家:上海賓智生物科技有限公司)和封片液(4，6-二脒基-2-苯基吲哚購自invitrogen公司)染色。最后采用免疫熒光顯微鏡(購自雅培公司)進行觀察，查找腫瘤細胞。以對數生長的肺腺癌A549細胞株為陽性對照組，以PBS代替一抗為陰性對照組，防止樣本出現異常現象，如樣本紅細胞裂解不完全導致成團、樣本紅細胞裂解后溶血。整個過程注意無污染、避光操作。

1.3 CTC的判定標準

形態(tài)學標準：①細胞呈圓形、橢圓形或長形，體積明顯大于血細胞；②光鏡下可見完整細胞形態(tài)。CTC免疫熒光染色結果判定：可以同時被CK和DAPI染色，不能被CD45染色。目前尚無國際標準化的陽性判定標準，本試驗以見到CTC即為陽性結果。出現陽性結果的患者在整個組中的比率即為陽性率。

1.4 統計學方法

應用SPASS 20.0軟件對獲得的實驗數據進行統計分析，計量組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者組、良性肺疾病患者組和健康空白對照組中CTC數量統計結果

肺癌患者組中CTC陽性率達80%(48/60),在良性肺疾病患者組和健康空白對照組中CTC陽性率為零，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 不同類型肺癌及不同分期肺癌患者CTC陽性率的分析

不同的肺癌類型CTC陽性率比較發(fā)現，循環(huán)細胞的陽性率與性別、肺癌類型無明顯關系(P>0.05),而Ⅰ期肺癌患者中CTC陽性率(40.00%)顯著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的CTC陽性率(85.71%、88.24%、100.00%)，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同類型及不同分期肺癌患者CTC陽性表達情況(例，%)

3 討論

近年來肺癌的發(fā)病率不斷升高，肺癌轉移與擴散也越來越復雜，傳統的肺癌檢測手段精確度與靈敏度受到一定的挑戰(zhàn)，臨床上頻繁出現肺癌的誤診情況[9-10]，不斷有研究者對傳統的診斷手段提出質疑，并且傳統的檢查方法很容易對患者造成有創(chuàng)傷害。為了能夠減少臨床誤診情況，更加合理的對肺癌患者進行診斷、治療、預后評估，需要綜合運用多種檢測技術對患者進行多角度、全方位、深層次的診斷[11]。檢測肺癌患者血液中循環(huán)腫瘤細胞手段作為一種新的肺癌的判斷方法越來越受大家重視，是目前臨床研究的熱點[12]。CTC的檢測手段已在乳腺癌中得到廣泛的應用[13]，其符合率達到95%～100%，并且對卵巢癌、晚期直腸癌和前列腺癌的診斷、治療、預后評估具有指導作用[14]。隨著Ficoll離心法和免疫磁珠法等CTC富集技術，流式細胞計數和聚合酶聯反應等CTC鑒定技術以及CTC芯片技術的應用[15]，CTC的檢測的敏感性和特異性越來越高[16-17]。若這些新技術的能廣泛應用于臨床，將會極大有助于肺癌的診治和預后判斷，預測肺癌的轉移情況，盡早采取有效的治療措施，提高肺癌患者的存活率。

我們通過對60例肺癌患者、10例良性肺疾病患者、10例健康對照著中外周血CTC的數量進行研究，統計結果顯示肺癌患者的CTC陽性率明顯高于良性肺疾病和健康對照組。并對不同性別和不同肺癌類型的CTC陽性率進行比較，其差異不具有統計學意義(P>0.05)，而不同肺癌分期的CTC陽性率差異具有統計學意義(P<0.05)。此研究結果與陳燕、鐘光華等人的研究結果基本一致[18-19]。說明CTC檢測具有一定的穩(wěn)定性、準確性和可重復性。但是CTC的評判標準和方法并未統一，為CTC檢測的廣泛應用帶來一定困難，因此進一步提升肺癌中CTC檢測的臨床應用價值對肺癌患者的診斷、治療和預后評估具有重大的臨床意義。