孫景武 劉志春 張 雷 張 龍 張 帆

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，5年生存率約為7%，已成為我國位居第二的惡性腫瘤致死病因[1-2]。目前，臨床上對肝癌診斷主要采用影像技術和血清標志物檢測相結合的方法[3]。影像技術由于技術的局限，對于小于1 cm的肝癌結節(jié)，超聲影像常常無法識別[4-5]。研究報道甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)陰性的肝癌患者CT、MRI和B超檢查診斷率分別為50.9%、50%、10.4%[6-7]；并且，一些肝結節(jié)性病灶如肝硬化再生結節(jié)、肝局灶性結節(jié)樣增生、肝腺瘤等也可出現類似肝癌的影像學表現，因此，肝癌易被誤診為肝臟良性疾病，導致患者失去早期治療的寶貴機會。由于血清標志物的變化可先于影像學和臨床癥狀出現改變前數月，甚至更長時間，因此，對于肝癌患者血清學標志物的研究也越來越受到各國學者的重視。原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)與膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是最為常見的2種肝臟惡性腫瘤。AFP是目前臨床上最常用的HCC診斷血清標志物，但是血清AFP水平并不總是與腫瘤的生長相關，早期單獨測定AFP，漏診率高達40%，即便在15～30%的晚期HCC患者中，血清AFP水平仍保持正常[8-9]；而關于ICC的診斷目前仍然缺乏相關診斷標志物，特別是對ICC與HCC鑒別診斷。2000年，Kladney等[10]發(fā)現一種新蛋白質-高爾基體蛋白73(golgi protein 73，GP73)，并指出其在肝癌細胞中有異常表達。因此，本研究旨在探討HCC和ICC患者血清GP73及AFP表達水平。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2015年1月至2017年7月期間入我院就診的HCC患者40例及ICC患者35例(排除已在外院接受手術、放化療或免疫治療的患者)，所有患者均經病理學確診。收取我院收治的乙型肝炎與肝硬化患者共50例。同期收取健康體檢者44例。研究對象均排除血液系統(tǒng)疾病、甲狀腺疾病、其他的良惡性腫瘤等。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 臨床資料與樣本采集及處理

收集所有納入對象的臨床資料如：年齡、性別、吸煙史、飲酒史、體重指數(body mass index，BMI)等，BMI計算方法為體重/身高2(kg/m2)。使用促凝采血管收集研究對象禁食10 h以上靜脈血5 ml。收集的標本在1 h內于4 ℃條件下以3 500 g離心力離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測。

1.3 臨床樣本的檢測

空腹抽取外周靜脈血在全自動生化儀AU5800(美國貝克曼庫爾特公司)進行相關生化指標檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測每組對象血清GP73水平，試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供，檢測過程嚴格按照試劑盒說明進行。血清AFP的檢測采用化學發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供，采用美國貝克曼庫爾特公司UniCel DxI 800分析儀進行檢測。質控品采用英國朗道公司腫瘤高、低值質控品，質控判斷標準為Westgard多規(guī)則分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 4組臨床資料比較

HCC組、ICC組、乙型肝炎與肝硬化組、健康對照組4組研究對象的臨床基本信息，見表1。4個組別間在年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與健康對照相比，HCC組、ICC組、乙型肝炎與肝硬化組患者谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酰轉肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)水平均增高，且差異具有統(tǒng)計學意義(HCC組 vs 健康對照：ALT，t=2.531，P<0.001；AST，t=2.368，P=0.014；GGT，t=2.266，P<0.001；TBIL，t=2.531，P=0.005；ICC組 vs 健康對照：ALT，t=2.317，P=0.010；AST，t=2.359，P=0.007；GGT，t=2.819，P<0.001；TBIL，t=2.744，P=0.002；乙型肝炎與肝硬化組 vs 健康對照：ALT，t=2.133，P=0.016；AST，t=2.065，P=0.021；GGT，t=2.428，P<0.001；TBIL，t=2.203，P=0.034)。而HCC組、ICC組、乙型肝炎與肝硬化組3組間ALT、AST、GGT和TBIL水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 研究對象的臨床基本信息比較

注：*為與健康對照相比,P<0.05。

2.2 研究對象血清AFP和GP73水平比較

HCC組、ICC組、乙型肝炎與肝硬化組、健康對照組4組研究對象血清AFP和GP73水平，見表2。4組間AFP和GP73水平差異具有統(tǒng)計學意義(AFP：F=4.017，P=0.003；GP73：F=5.331，P<0.001)。與HCC組相比，ICC組、乙型肝炎與肝硬化組和健康對照血清AFP和GP73水平均顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(HCC組 vs ICC組：AFP，t=3.446，P<0.001；GP73，t=6.190，P<0.001；HCC組 vs 乙型肝炎與肝硬化組：AFP，t=3.205，P<0.001；GP73，t=5.478，P<0.001；HCC組 vs 健康對照：AFP，t=3.963，P<0.001；GP73，t=5.712，P<0.001)。而ICC組、乙型肝炎與肝硬化組和健康對照血清AFP和GP73水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 研究對象血清AFP和GP73水平

注：#為與HCC組相比，P<0.05。

2.3 AFP、GP73水平與HCC、ICC臨床特征的關系

如表3所示，HCC患者血清GP73與淋巴結轉移(有vs無：t=3.817，P=0.005；R2=0.289，P<0.001)和TNM分級(Ⅰ～Ⅱ vs Ⅲ～Ⅳ：t=-3.285，P=0.013；R2=0.256，P<0.001)呈線性關聯(lián)。而在HCC和ICC的其他分組中，各組血清AFP和GP73水平的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 ROC曲線分析

以HCC患者為病例組；分別以非腫瘤組和ICC組患者為對照組進行ROC曲線分析。結果顯示，血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與非腫瘤組的AUC分別為：0.860(95% CI：0.792～0.928，P<0.001)和0.765(95% CI：0.684～0.847，P<0.001)；靈敏度/特異度分別為：78.3%/91.2%和64.7%/76.1%；對應的臨界值分別為：37.1 ng/ml和26.3 ng/ml，見圖1A。聯(lián)合血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與非腫瘤組的AUC為0.904(95% CI：0.850～0.957，P<0.001)，靈敏度81.7%，特異度89.8%，見圖1B。血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與ICC患者的AUC分別為：0.845(95%CI：0.774～0.917，P<0.001)和0.721(95% CI：0.635～0.808，P<0.001)；靈敏度/特異度分別為：80.1%/87.6%和73.2%/62.4%；對應的臨界值分別為：36.5 ng/ml和25.6 ng/ml，見圖1C。聯(lián)合血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與ICC患者的AUC為0.864(95% CI：0.800～0.928，P<0.001)，靈敏度78.5%，特異度90.4%，見圖1D。

表3 血清AFP和GP73水平與HCC和ICC臨床病理特征間的關系

注：A圖示血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與非腫瘤組的ROC曲線；B圖示聯(lián)合血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與非腫瘤組的ROC曲線；C圖示血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與ICC患者的ROC曲線；D圖示聯(lián)合血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與ICC患者的ROC曲線。

3 討論

肝癌的早期癥狀不明顯，一旦發(fā)現，往往已屬中晚期，失去了臨床最佳治療期[11]。AFP是HCC最重要和最傳統(tǒng)的血清學診斷指標，但在早期HCC中單獨測定AFP，漏診率較高；值得注意的是，AFP陰性HCC占HCC的30%～40%，是目前導致很多HCC患者失去早期診療機會的一類重要肝癌，特別是在瘤體小于3 cm的HCC中尤為常見[12-13]。ICC屬原發(fā)性肝癌的一種，其發(fā)病誘因較多，包括乙型肝炎病毒感染、K-ras基因突變、肝吸蟲感染、膽管囊性畸形、膽管結石等。報道指出，近20%的ICC患者血清AFP水平可有輕度升高，而影像學檢查有時與HCC、肝膿腫難以鑒別[14]。目前，臨床鑒別HCC與ICC主要依據病理切片，但病理檢查最大的局限性是其自身具有的有創(chuàng)性，導致部分患者不愿意接受檢查而發(fā)生誤診或錯過早期診斷。因此，臨床上迫切需要找尋具有更高敏感性、特異度的生物標志物，以在HCC與ICC鑒別診斷中發(fā)揮價值，提高診療質量。

GP73是一種位于高爾基體的Ⅱ型跨膜糖蛋白，分子量約為73 kD[10]。 既往的研究表明，GP73與多種肝臟疾病，特別是HCC的發(fā)生發(fā)展關系緊密，國內已經有報道指出GP73在肝病發(fā)展過程中其表達是逐步上調的：在正常肝細胞內幾乎不表達GP73，但在肝臟出現急性炎癥或較嚴重的肝纖維化時GP73可有輕度上升，而當發(fā)展到HCC時，GP73的表達可迅速升高并達到很高水平[15]。因此，體內GP73的水平被認為與HCC發(fā)生過程緊密相關，有可能成為HCC的候選標志物。然而，關于GP73在HCC及ICC中的水平是否存在差異，并且其對HCC的診斷意義大還是對ICC的診斷意義大，國內尚未見報道?；诖耍狙芯恐荚谔接慔CC和ICC患者血清GP73及AFP表達水平，以期為找尋肝癌早期診斷標志物提供更為有利的證據。

本研究我們首次檢測GP73在ICC患者中的水平，結果顯示，與HCC組相比，ICC組、乙型肝炎與肝硬化組和健康對照血清AFP和GP73水平均顯著降低，而ICC組、乙型肝炎與肝硬化組和健康對照血清AFP和GP73水平差異無統(tǒng)計學意義。我們的研究結果與前期研究發(fā)現GP73在HCC中高表達相一致[15]。進一步的分析發(fā)現，HCC患者血清GP73水平與淋巴結轉移和TNM分級相關，而GP73水平與ICC的臨床病理特征無顯著相關。Zhao等[16]的基礎研究指出GP73參與到HCC的侵襲與轉移，與我們本次的臨床研究結果相符，提示GP73在預測HCC患者發(fā)生遠處轉移具有重要意義。ROC曲線分析顯示，血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與非腫瘤組時的靈敏度/特異度分別為：78.3%/91.2%和64.7%/76.1%，當聯(lián)合血清GP73和AFP時具有較高的價值，靈敏度為81.7%，特異度為89.8%。此外，我們還發(fā)現血清GP73和AFP在區(qū)分HCC與ICC患者時同樣具有較高的臨床價值，靈敏度/特異度分別為：80.1%/87.6%和73.2%/62.4%，當兩者聯(lián)合時，鑒別HCC與ICC的特異度達到90.4%。本次研究中，AFP在鑒別HCC與非腫瘤組和ICC的靈敏度/特異度分別為64.7%/76.1%和73.2%/62.4%，其具有的HCC診斷靈敏度和特異性也與國內外的研究報道數據相符合[4,17]。上述研究提示，血清GP73對于HCC的鑒別診斷具有很好的價值，特別是在與AFP聯(lián)合時。本次研究中AFP在鑒別HCC與非腫瘤、HCC與ICC的臨界值分別為26.3 ng/ml和25.6 ng/ml，較高于臨床制定的AFP參考值上限(25.0 ng/ml)，我們推測主要的原因包括：①本次納入的研究對象人數較少，因此仍需要更大規(guī)模的臨床研究來證實我們的結果；②臨床上診斷HCC時的正常值的設定是基于健康人群水平的95%置信區(qū)間設定的，而我們本次得到的臨界值是在分析這些指標區(qū)分肝炎、肝硬化甚至是ICC時獲得的，這是使得臨界值高于正常參考值上限的又一個重要原因。

綜上，通過本次實驗我們首次同時探討了HCC與ICC血清GP73水平的差異表達，發(fā)現GP73在HCC鑒別診斷上優(yōu)于AFP的診斷效能，當聯(lián)合GP73與AFP時在HCC與ICC及HCC與非腫瘤患者鑒別診斷具有更高的價值，有望為找尋HCC的診療提供新的途徑與思路。