楊振方

自噬現(xiàn)象在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮促進和抑制的雙重作用，目前仍存在爭議[1-3]。Beclin1被認為是一種抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)其生物學行為可能存在促癌的活動，例如與p62結腸癌中的協(xié)同作用[4]。已有研究報道了結腸癌組織中Beclin1、p62的表達及其與臨床病理特征關系[5]，而結腸癌組織中Beclin1、p62的表達及其與預后關系鮮見報道。本研究旨在觀察結腸癌組織中免疫組化Beclin1、p62染色情況，并探討其與結腸癌患者生存預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016年5月至2017年10月我院保存的55例手術切除的結腸癌石蠟包埋標本。所有組織標本經(jīng)活檢證實為結腸癌，所有病例有完整隨訪資料、術前未接受過放化療。每例標本取癌組織和癌旁正常黏膜組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。其中，年齡(48～75)歲，平均(60.55±5.28)歲；性別：男性35例，女性20例；組織學分型：腺癌18例，黏液腺癌37例；TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期28例，Ⅲ期13例，Ⅳ例10期；發(fā)病部位：左半結腸28例，右半結腸27例；遠處淋巴結轉(zhuǎn)移：有14例，無41例。

1.2 免疫組化染色

組織標本均采用多聚甲醛固定，在病理切片前用磷酸緩沖液梯度脫水，病理切片后用二甲苯進行脫蠟，再以酒精梯度脫水，過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，放置病理標本恒溫柜中孵育10 min(環(huán)境溫度27 ℃)，一抗過夜處理(Beclin1兔多抗、p62鼠單抗)，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法放大一抗的信號，再次放置病理標本恒溫柜中孵育60 min(環(huán)境溫度27 ℃)，二氨基聯(lián)苯胺顯色，滴加檸檬酸組織抗原修復液，封片后用顯微鏡觀察染色結果。

1.3 結果判定 Beclin1陰陽性判斷標準

細胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒判定為陽性，呈淡藍色樣則判定為陰性。p62陰陽性判斷標準：細胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒判定為陽性，無染色則判定為陰性。讀取3個400倍視野下的Beclin1、p62陽性染色細胞計數(shù)，取其平均值。染色細胞強度評分：無染色記0分，淡黃色顆粒記1分，黃色顆粒記2分，棕黃色顆粒記3分；染色細胞比例評分：陽性染色細胞數(shù)<25%記0分，25%～50%記1分，51%～75%記2分，≥76%記3分。染色細胞強度評分和染色細胞比例評分的和等于0分為陰性(-)、(1～2)分為弱陽性(+)、(3～4)分為中強陽性(++)、(5～6)分為強陽性(+++)。陽性率=(-)+(++)+(+++)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均應用SPSS 20.00統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理。死亡定義為終點事件，生存時間為手術日期至死亡日期。計算生存率采用 Ka-plan-Meier方法，生存率比較應用Log-rank檢驗；多因素預后分析采用COX風險比例模型，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 結腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中Beclin1染色情況比較

結腸癌組織中Beclin1陽性表達率顯著低于癌旁正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 結腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中Beclin1表達情況比較(例，%)

2.2 結腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中p62表達情況比較

結腸癌組織中p62陽性表達率顯著高于癌旁正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 結腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中p62表達情況比較(例，%)

2.3 單因素生存分析

Beclin1陽性病例5年生存率為71.42%(10/14)，陰性則為26.47%(9/34)；p62陽性病例5年生存率為28.20%(11/39)，陰性則為63.63%(7/11)。Log-rank檢驗結果顯示，Beclin1表達與生存期呈顯著正相關(P<0.05)；p62表達與生存期呈顯著負相關(P<0.05)。

2.4 多因素生存分析

以Ka-plan-Meier結果為應變量，以性別(0=男、1=女)、年齡(連續(xù))、發(fā)病部位(0=左半結腸、1=右半結腸)、病理分級(0=G1、1=G2、2=G3)、TNM分期(0=Ⅰ期、2=Ⅱ期、3=Ⅲ期、4=Ⅳ期)、遠處淋巴結轉(zhuǎn)移(0=有、1=無)、Beclin1(0=陰、1=陽)、p62(0=陰、1=陽)為協(xié)變量，代入Cox比例風險模型分析后發(fā)現(xiàn)，Beclin1是結腸癌患者獨立的生存預后因素(B=-0.926，RR=0.314，P<0.05)；p62是結腸癌患者獨立的生存預后因素(B=1.521，RR=4.337，P<0.05)。

3 討論

自噬現(xiàn)象是調(diào)控自噬的相關基因利用細胞溶酶體消化細胞自身的蛋白質(zhì)和細胞器的過程。Beclin1是調(diào)控自噬的相關基因，Beclin1蛋白是1種調(diào)節(jié)自噬現(xiàn)象的蛋白質(zhì)，其通過與Class Ⅲ PI3K結合來介導自噬體的形成[6]。研究報道，肺癌、胃癌及結腸癌細胞中存在Beclin1等位基因的缺失現(xiàn)象[7-9]；結腸癌、前列腺癌及甲狀腺癌等實體瘤組織中存在不同程度的Beclin1 mRNA表達下調(diào)[10-12]。本研究觀察到，結腸癌組織中Beclin1陽性表達率比癌旁正常黏膜組織低，在統(tǒng)計學上有意義。說明，Beclin1基因缺失或點突變可降低結腸癌細胞的自噬性死亡能力，結腸癌細胞的自噬性死亡能力明顯低于癌旁正常黏膜組織細胞。

Beclin1與p62在結腸癌發(fā)病過程中具有協(xié)同作用，Beclin1基因缺失或點突變使自噬發(fā)生缺陷時，可使自噬底物p62聚集，p62通過介導NF-κB信號途徑導致腫瘤[13-15]。本研究觀察到，結腸癌組織中p62陽性表達率比癌旁正常黏膜組織高，在統(tǒng)計學上有意義。提示，p62不但參與了結腸癌的發(fā)病，而且p62是Beclin1基因所調(diào)控通路自噬活性的生物標志物。

本研究觀察到，Beclin1表達與生存期呈顯著正相關，p62表達與生存期呈顯著負相關。提示，Beclin1、p62可能參與了結腸癌的發(fā)生和進展，結腸癌組織中Beclin1的表達下調(diào)、p62的表達上調(diào)，有增加死亡風險的趨勢。本研究同時觀察到，Beclin1、p62是結腸癌患者獨立的生存預后因素。提示，Beclin1陽性是結腸癌患者生存預后的獨立保護因素；p62陽性是結腸癌患者生存預后的獨立危險因素。由此，Beclin1、p62可作為生物標志物，為結腸癌患者生存預后評估提供依據(jù)。

綜上所述，本研究探討了結腸癌組織中Beclin1、p62的表達及其與預后關系。