羅慶豐 修穆群 高 文 羅淑蘭 楊 劍 張小芳 付愛榮

鼻咽癌是我國常見的頭頸惡性腫瘤,早期轉移是其主要的臨床癥狀,局部復發(fā)是影響治療效果的主要原因，我們通過研究鼻咽癌的患者腫瘤組織的ZEB2的表達狀態(tài)，探索腫瘤轉移和復發(fā)機制，降低腫瘤復發(fā)率，改善治療效果，提高患者生存時間。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2009年3月至2012年5月收集132例在江西省腫瘤醫(yī)院治療鼻咽癌患者，其中男性∶女性為73∶59，年齡27～70歲，中位年齡56歲；患者均經(jīng)病理檢查確診為非角化性癌，收集患者5年隨訪資料。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 試劑 ZEB2蛋白單克隆抗體(即用型)及MaxvisionTM免疫組化試劑盒購自公司，ZEB2蛋白為羊抗人原液，參考滴度1∶200。

1.2.2 方法 ZEB2和E-caderin蛋白檢測采用MaxvisionTM免疫組化法，操作按說明書進行：①4 μm厚度切片，裱于涂有APES的防脫載玻片上，70 ℃烤片1 h;②脫蠟，逆梯度乙醇入水；③ 3%過氧化氫室溫孵育30 min，消除內源性過氧化物酶；④抗原修復：切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中，電飯鍋中煮沸5 min，保溫10 min，自然冷卻；PBS洗,3 min×2次；⑤加入ZEB2抗體，4 ℃冰箱12 h；⑥復溫，PBS洗去一抗3 min×2次；⑦滴加抗體增強劑；⑧ 滴加Maxvision試劑，室溫作用1 h；⑨PBS洗3 min×2次；⑩DAB光鏡下顯色，蘇木精復染，封片。光鏡下觀察ZEB2蛋白在鼻咽癌中表達。陽性對照：購自英國Abcam公司ZEB2蛋白乳腺癌陽性組織片。陰性對照：PBS代替一抗。

1.2.3 結果判斷 細胞細胞質呈棕黃色顆粒沉著者為ZEB2蛋白陽性表達。細胞細胞膜呈棕黃色顆粒沉著者為E-caderin蛋白陽性表達，選擇陽性表達區(qū)的4個高倍視野，記數(shù)400個以上細胞，根據(jù)腫瘤陽性細胞數(shù)及細胞染色強度進行半定量根據(jù)著色強度及顯色癌細胞比例將染色結果分為-、+、++和+++級；評分方法為：染色強度0分為無著色；1分為淺棕色; 2分為棕色，計; 3分為棕褐色。染色腫瘤細胞數(shù)百分比:0分為無陽性細胞; <10%，計1分; 10%～<50%，計2分; 50%～<75%，計3分;≥75%，計4分。最后評分結果為兩強度和百分比計分結果相乘之積，結果分為①陰性表達:<4分為(-);②陽性表達:評分≥4～<6分為(+),≥6～<9分為(++),9≥～<12分為(+++) 。

1.2.4 分期方法 按國際抗癌聯(lián)盟 UICC 分期第8版鼻咽癌分期標準對入組的鼻咽癌患者進行TNM分期。淋巴結轉移陽性診斷通過MRI影像學確診。

1.3 統(tǒng)計方法

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理評價分析，采用非參數(shù)秩和分析spearman相關分析。

2 結果

2.1 ZEB2蛋白表達和E-caderin 蛋白與鼻咽癌臨床病理特征的關系

ZEB2蛋白和E-caderin 蛋白表達與淋巴結及遠處轉移密切相關，淋巴結轉移患者和遠處轉移患者ZEB2陽性和E-caderin 蛋白表達率明顯高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)；ZEB2蛋白和E-caderin 蛋白陽性表達均與鼻咽癌TNM分期顯著相關(P<0.05)。ZEB2蛋白與鼻咽癌病理分型顯著相關(P<0.01)，見表1。

2.2 ZEB2蛋白與E-caderin蛋白表達的相關性

鼻咽癌組織中ZEB2蛋白表達與E-caderin蛋白陽性表達有顯著負相關性(P<0.05)，見表2。

表1 ZEB2蛋白與E-caderin蛋白表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系/例

表2 ZEB2蛋白與E-caderin 蛋白表達的關系/例

3 討論

鼻咽癌在我國南方高發(fā)的惡性腫瘤，侵襲和轉移能力較強，常常發(fā)生頸部轉移。癌細胞上皮間質轉化(epithelial-mesen-chymaltransition，EMT)是腫瘤侵襲和轉移的1個重要的過程，癌細胞上皮間質轉化是指上皮細胞腫瘤細胞失去原有的形態(tài)結構、排列極性及細胞間的緊密連接架構，細胞表面黏附分子和細胞肌動蛋白微絲骨架重塑，最終瘤細胞由圓形轉變成梭形外觀同時具有較強遷移能力的間質細胞表型的過程[1]。癌細胞上皮間質轉化廣泛參與癌巢的增殖、免疫逃逸、轉移及間質血管生成的調控，是腫瘤細胞侵襲轉移中關鍵步驟，本研究探究ZEB 家族調控的EMT及相關蛋白在鼻咽癌發(fā)生侵襲轉移機制中的作用，為鼻咽癌的治療提供了新的靶點。

鋅指增強子結合蛋白-2( (zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)是二鋅指蛋白家族的1個成員，含有兩個鋅指集群，N-末端鋅指簇(NZF)包含4個鋅指結構(3個CCHH，1個CCHC)，C-末端鋅指簇(CZF)包含3個CCHH鋅指結構，通過與相關DNA序列結合[2]，產(chǎn)生轉錄作用，是重要的細胞核轉錄因子，大量的體內外實驗發(fā)現(xiàn)ZEB2介導了EMT的發(fā)生，通過EMT控制腫瘤細胞的播散，Xavier 等[3]通過對犬的乳腺癌癌細胞株研究發(fā)現(xiàn)ZEB2可以通過stat和CDH基因調控癌細胞浸潤能力，ZEB2可以通過TGF-β1轉錄因子作用，促進上皮的間質轉化，該機制在腎細胞癌[4]和卵巢腫瘤[5]中得到證實。這與本研究結果ZEB2蛋白陽性表達與鼻咽癌的病理分化相關的結果相一致。ZEB2與E-cadherin 編碼基因的啟動子上的E2盒的[CACCT(G)]結合，抑制E-cadherin 的轉錄，誘導細胞發(fā)生EMT，增強細胞的侵襲轉移能力，E-cadherin表達的下調是上皮間質轉化過程中的關鍵事件[6]。E-cadherin表達的缺失與多種人體腫瘤相關，如大腸癌、食管癌、乳腺癌、胃癌等。實驗證明具有高侵襲能力的腫瘤細胞重新表達E-cadherin，則其侵襲能力喪失；相反抑制上皮細胞中 E-cadherin 的表達，可使得細胞獲得間質細胞樣表型，侵襲遷移能力增強，本研究結果中顯示中ZEB2蛋白陽性表達與鼻咽癌TNM分期結果比較有顯著性差異，隨著分期升高表達率升高，表明ZEB2的高表達導致EMT的發(fā)生，促進了腫瘤的浸潤能力的提高。Brown 等[7]對乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)ZEB2 通過微小RNA-155和FOXP3路徑，負反饋調節(jié)ZEB2 表達，上調E-cadherin表達，抑制腫瘤細胞的EMT,E-cadherin表達的缺失使得細胞黏附能力降低，導致EMT的發(fā)生，細胞遷移運動能力增強，從而促進腫瘤侵襲與轉移。Ren等[8]通過對口腔鱗狀細胞癌的研究也證明miR-200b可以通過上調ZEB2 表達,促進遷移和浸潤。本研究結果顯示ZEB2蛋白陽性表達與鼻咽癌轉移能力比較有顯著性差異，而且無轉移組、淋巴結轉移組和遠處轉移組陽性表達率逐步升高，表明ZEB2參與鼻咽癌的進展及轉移。

腫瘤ZEB 家族調控的EMT在鼻咽癌侵襲轉移機制中及預后中發(fā)揮重要作用，能夠成為治療干預鼻咽癌的新靶點。