王 霞，王廷璞，王弋博，趙天宇

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院；甘肅 天水 741001）

肺炎克雷白桿菌(Klebsiella pneumoniae)是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性致病菌，屬于腸桿菌科(Entero?bacteriaceae)克雷白菌屬(klebsiella)，1882年由Frie?diander從患大葉性肺炎患者的肺組織中首次分離得到。[1]75%～86%克雷白菌屬導(dǎo)致的感染是由肺炎克雷白桿菌所導(dǎo)致，侵襲性克雷白桿菌感染的病死率為17.5%～23.0%，[2-4]其為醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌之一。其生物學(xué)特征為兼性厭氧型，形態(tài)粗短桿菌，無(wú)鞭毛，有較厚的莢膜。多數(shù)菌株有菌毛,具有菌體抗原(O抗原)、莢膜抗原(K抗原)、菌毛抗原等多種主要抗原成分，但是不具備運(yùn)動(dòng)的能力。然而目前對(duì)肺炎克雷白桿菌的致病機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。

II型分泌系統(tǒng)（T2SS）廣泛存在于致病菌革蘭氏陰性細(xì)菌中，T2SS負(fù)責(zé)分泌從周質(zhì)到細(xì)胞外環(huán)境中的折疊蛋白。[5]T2SS是由一個(gè)簡(jiǎn)單的操縱子編碼的12～15個(gè)稱(chēng)之為Gsp(General secretory pathway)蛋白（Escherichia coli）組分組成，[6]T2SS包括四部分：一個(gè)外膜復(fù)合體，一個(gè)周質(zhì)pseudopilus，一個(gè)內(nèi)膜基底層和一個(gè)胞質(zhì)ATP酶。外膜復(fù)合物主要由GspD蛋白組成，內(nèi)膜基底層通常是由至少4個(gè)膜蛋白組成，比如GspC,GspF,GspL和GspM，周質(zhì)假纖毛結(jié)構(gòu)主要由GspG組成，GspE主要是胞質(zhì)ATP酶的組分。[7-8]有研究表明植物病原細(xì)菌通過(guò)T2SS分泌降解植物細(xì)胞壁的酶及多種毒性因子，破壞寄主細(xì)胞，導(dǎo)致組織壞死。[9]此外，T2SS在細(xì)菌的致病過(guò)程中同樣具有舉足輕重的作用。[10-11]這就說(shuō)明II型分泌系統(tǒng)與細(xì)菌致病性之間有著密切關(guān)系。為了揭示其致病機(jī)制打下良好基礎(chǔ)，深入研究肺炎克雷白桿菌GspD-k的功能，我們對(duì)II型分泌系統(tǒng)中外膜復(fù)合物組分GspD-k進(jìn)行生物信息等方面的分析研究。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

數(shù)據(jù)為NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得肺炎克雷白桿菌的GspD-k基因及氨基酸序列（表1）。

1.2 肺炎克雷白桿菌GspD-k和大腸桿菌GspD序列比對(duì)分析

一方面在NCBIBlast中將GspD-k和GspD序列進(jìn)行比對(duì)，另一方面在Clustalw中先進(jìn)行比對(duì)，再通過(guò)ESPript網(wǎng)站輸出比對(duì)的保守氨基酸序列（表1）。

1.3 GspD-k蛋白理化參數(shù)計(jì)算

按照軟件Protparam所提示的要求，將GspD-k蛋白序列輸入正確的格式，點(diǎn)擊計(jì)算，從而獲得該蛋白的基本理化性質(zhì)（表1）。

1.4 GspD-k的氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

GspD-k信號(hào)肽序列的有無(wú)采用SignalP 4.1在線軟件進(jìn)行分析（Petersen etal.,2011），采用TMHMM Server v.2.0軟件進(jìn)行蛋白跨膜分析（韓麗珍等，2014）；采用軟件PSORT和TARgetP對(duì)GspDk進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位分析（表1）。

1.5 GspD-k蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)評(píng)估

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)包括α-螺旋和β-折疊、β-轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)卷曲和連接幾種結(jié)構(gòu)的延伸鏈。在線軟件PredictProtein來(lái)預(yù)測(cè)GspD-k氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)；在線軟件Phyre 2分析GspD-k氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)模型（表1）。

表1 GspD-k生物信息分析在線軟件網(wǎng)址

2 結(jié)果與分析

2.1 肺炎克雷白桿菌T2SS組分GspD-k基因座位分析

通過(guò)在NCBI網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷白桿菌中T2SS組分中GspE-k基因座位的為CDK79923，GspC-k的是CDK79921，GspG-k對(duì)應(yīng)的基因座位為CDK77150，GspD-k對(duì)應(yīng)的基因座位為CDK77145，從基因座位序列看，肺炎克雷白桿菌T2SS中GspD-k的基因座位并沒(méi)有很緊密的和GspE-k緊靠在一起，研究的較為清楚的大腸桿菌中T2SS組分GspD和GspE都是緊密相鄰，且與其他組份都排列在一起形成一個(gè)基因簇。這說(shuō)明肺炎克雷白桿菌T2SS組分GspD-k在基因座位排列中有一定的獨(dú)特性。

2.2 GspD-k氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

將GspD-k的蛋白序列輸入ProtParam在線軟件，分析結(jié)果顯示該蛋白總共654個(gè)氨基酸，其總分子量為71132.66 Da；其等電點(diǎn)偏酸，達(dá)5.41.在氨基酸組成中（表2），GspD-K含有20種氨基酸，含量較為豐富的是亮氨酸（9.9%）、纈氨酸（9.5%）；色氨酸的含量最少，僅為0.5%；不含吡咯賴(lài)氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。對(duì)蛋白序列中的氨基酸殘基帶電性質(zhì)進(jìn)行分析表明，其中帶正電荷殘基（精氨酸和賴(lài)氨酸）達(dá)65，帶負(fù)電荷的（天冬氨酸和谷氨酸）為75個(gè)。

表2 GspD-K蛋白氨基酸組成

2.3 GspD-k與大腸桿菌GspD氨基酸序列比對(duì)

目前大腸桿菌中的GspD蛋白的研究較為清楚，GspD具有474個(gè)氨基酸，如上所述肺炎克雷白桿菌GspD-k有654個(gè)氨基酸。在NCBIblast中對(duì)二者進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者的相似性為59%.另外，為了找到與GspD相似的保守氨基酸位點(diǎn)，我們?cè)赾lustalw在線網(wǎng)站對(duì)GspD和GspD-k蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，最后在ESPript中做出如下所示結(jié)果圖片（圖1）。結(jié)果顯示紅色區(qū)域?yàn)橐恢碌陌被?，屬于二者保守的序列。但還需要對(duì)其保守位點(diǎn)進(jìn)一步做突變確定關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)。

2.4 肺炎克雷白桿菌T2SS組分GspD-k保守結(jié)構(gòu)域分析

在CD Search上的分析表明GspD-K氨基酸序列有一個(gè)屬于Secretin superfamily的保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步通過(guò)SMARTPfam domain在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果如下圖2所示，GspD-K氨基酸序列有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是3個(gè)Secretin_N結(jié)構(gòu)域，1個(gè)Secretin結(jié)構(gòu)域，3個(gè)Secretin_N結(jié)構(gòu)域所處氨基酸序列分別為 131aa～193aa,196aa～268aa,272aa～351aa.Secretin結(jié)構(gòu)域?yàn)?73-599aa.

2.5 GspD-k蛋白的功能結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

有些蛋白質(zhì)的氨基酸N端帶有信號(hào)肽，一半長(zhǎng)度為15～30個(gè)氨基酸。信號(hào)肽的預(yù)測(cè)有助于確定該蛋白的亞細(xì)胞的定位。同時(shí)還能為蛋白肝功能域的劃分提供較為可靠的參考；以D-cutoff=0.450，用SignalP 4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽（圖3），結(jié)果顯示最大的Y（Max.Y） 值為 0.541，最大的 S（Max.S） 值為0.900，S的平均值（mean S）為0.783，表明GspD-k含有信號(hào)肽序列，并且信號(hào)肽序列為1～27aa.這說(shuō)明GspD-k是分泌蛋白。

圖1 GspD-k與大腸桿菌GspD氨基酸序列比對(duì)

圖2 肺炎克雷白桿菌T2SS組分GspD-k保守結(jié)構(gòu)域分析

蛋白的跨膜分析軟件TMHMM Server v.2.0對(duì)該多肽生物信息預(yù)測(cè)顯示（圖4），其跨膜螺旋個(gè)數(shù)為0，跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值為1.16685（超過(guò)18個(gè)，可能含跨膜螺旋或者含有信號(hào)肽），而蛋白前60個(gè)氨基酸中跨膜螺旋的氨基酸數(shù)量的期望值0.39516，N端位于膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的總概率為0.05693.蛋白位于細(xì)胞膜外側(cè)的可能性是1左右，綜上所述，推測(cè)GspD-K蛋白可能位于細(xì)胞膜外，不具有跨膜螺旋。PSORT亞細(xì)胞定位軟件則進(jìn)一步明確該蛋白定位于外膜上（表3）。

利用ProtScale分析GspD-k蛋白的親疏水性，結(jié)果表明（圖5）疏水氨基酸所占比例為44.95%，親水性氨基酸所占比例為53.82%.其中，疏水性最強(qiáng)的是第17位的丙氨酸，其值為2.856；親水性最強(qiáng)的是第618位的谷氨酰胺，其值為-3.589.由于親水性區(qū)域較大于疏水性區(qū)域，因此，我們認(rèn)為GspD-k蛋白為偏親水性蛋白。

2.6 GspD-k蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用PredictProtein軟件分析Gsp-K蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明表α-螺旋的比例是21.87%，β-折疊的比例是24.01%，無(wú)規(guī)則Loop環(huán)所占比例為54.13%（表4）。即無(wú)規(guī)則loop環(huán)是GspD-k蛋白中主要組成原件（圖6）。這有利于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

圖3 SignalP 4.1預(yù)測(cè)Gsp-k蛋白的信號(hào)肽

圖4 TMHMM對(duì)GspD-k蛋白跨膜性分析

表3 PSORT對(duì)GspD-k蛋白亞細(xì)胞定位分析

圖5 ProtScale預(yù)測(cè)GspD-k蛋白的親疏水性

運(yùn)用phyre2對(duì)GspD-k蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬預(yù)測(cè)（圖7），氨基酸序列從氨基端到羧基端以箭頭表示。預(yù)測(cè)結(jié)果和c5WQ9L蛋白（II型分泌系統(tǒng)D蛋白）的三級(jí)機(jī)構(gòu)模型相似性為47%.其模型三維分別用X,Y和Z來(lái)表示。X值為38.442，Y值為90.604,Z值為196.293.

表4 GspD-k蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 結(jié) 論

應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，對(duì)肺炎克雷白桿菌II型分泌系統(tǒng)組分GspD-k基因及其蛋白序列結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GspD-k為含有信號(hào)肽序列并存在于細(xì)胞膜上的較為穩(wěn)定的外膜蛋白。此外GspD-k蛋白中的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有三種，即α-螺旋，β-折疊和無(wú)規(guī)則Loop環(huán)，Loop環(huán)占主要比例。本研究為深入研究肺炎克雷白桿菌GspD-k的功能及其致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

圖7 phyre2預(yù)測(cè)GspD-k蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)