朱紫薇，周忠光，韓玉生

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺癌是全球范圍內(nèi)患病率和死亡率最高的惡性腫瘤，也是人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。肺癌有多種病理分型，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%以上[2],肺腺癌占非小細(xì)胞肺癌的50%。從腫瘤細(xì)胞學(xué)方面來看，肺癌發(fā)生的本質(zhì)在于細(xì)胞異常增殖與凋亡的調(diào)節(jié)失控有關(guān)[3]。中醫(yī)典籍中并無肺癌這一直接病名，但根據(jù)肺癌的臨床癥狀和體征，本病的相關(guān)論述散見于 “肺巖”“胸痛”“咯血”“息賁”“肺萎”“肺癰”等證的范疇。可見正氣不足在先，繼而痰、濕、氣、瘀、熱、毒搏結(jié)為患，本虛標(biāo)實(shí)貫穿始終，故治療上以扶正祛邪為基本原則[4]?？v觀各醫(yī)家之論，治法多以扶正培本、解毒散結(jié)、化痰祛濕、活血化瘀為主。白露湯為自擬方劑，是在臨床治療肺癌過程中確立，療效確切，具有扶正解毒、清肺消腫的功效。方中靈芝[5]補(bǔ)氣、止咳、平喘，露蜂房散結(jié)解毒，白僵蠶化痰散結(jié)、止痙止痛，干蟾皮清熱解毒[6]、利水消腫[7]。四藥合奏顯現(xiàn)中藥的抗癌的優(yōu)勢(shì)，可對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖周期進(jìn)行調(diào)控與誘導(dǎo)凋亡[8]。本研究觀察了白露湯含藥血清對(duì)人肺癌A549細(xì)胞活力、凋亡及生長(zhǎng)周期的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 細(xì)胞株培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，恒溫培養(yǎng)箱中通入5% CO2飽和濕度培養(yǎng)，2～3天進(jìn)行一次換液傳代(用胰酶進(jìn)行消化傳代)。

1.2 藥物

白露湯中靈芝、白僵蠶、露蜂房和干蟾皮4種藥物飲片均購(gòu)于黑龍江省哈爾濱市醫(yī)藥藥材總公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院鑒定為正品。上述中藥飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心制備，生藥含量為0.9 g/mL。

1.3 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱HF-90(上海力申)；多功能酶標(biāo)儀M200PRO(瑞士TECAN 公司)；超速冷凍離心機(jī)H-2050R(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱DH36001B(天津泰斯特)；倒置相差顯微鏡AE31(麥克奧迪)；電泳儀及垂直電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4 試劑

胎牛血清(BI公司，美國(guó)，貨號(hào)04-001-1ACS)； RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司，美國(guó)，貨號(hào)12100-46)； CCK8試劑盒(萬(wàn)類生物公司，中國(guó)，批號(hào)WLA074b)；噻唑藍(lán)、蛋白酶抑制劑、順鉑(Sigma 公司，美國(guó))；細(xì)胞凋亡溴化乙啶(EB)染色試劑盒(南京凱基)；Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海晶美)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(萬(wàn)類生物公司，中國(guó))；RIPA裂解液， HIF-1α等抗體(萬(wàn)類生物公司，中國(guó))；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin) 兔單克隆抗體，抗 EGFR 兔單克隆抗體、HRP-羊抗兔 IgG 酶標(biāo)二抗(全式金公司，中國(guó)北京)。

2 方法

2.1 細(xì)胞分組

將培養(yǎng)好的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組，白露湯低、中、高劑量含藥血清組(簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組)，陽(yáng)性藥組(即順鉑組)。做好標(biāo)記，并分別加入對(duì)應(yīng)的溶劑。

2.2 含藥血清的制備

給予大鼠灌服處理過的白露湯，按照25 mL/kg的劑量灌胃給藥，每天2次，連續(xù)7天。末次給藥前禁食12 h，于末次給藥1 h后，大鼠腹主動(dòng)脈取血。室溫下靜置30 min，取上清液3 000 rpm離心15 min，于56℃水浴中滅活30 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜備用。

2.3 低、中、高含藥血清的配比

低劑量的含藥血清是藥物血清與正常DMEM培養(yǎng)基以1∶40體積配比；中劑量的含藥血清是藥物血清與正常DMEM培養(yǎng)基以1∶20體積配比；高劑量的含藥血清是藥物血清與正常DMEM培養(yǎng)基以1∶10體積配比。

2.4 CCK-8檢測(cè)

白露湯低、中、高劑量組，順鉑組與空白對(duì)照組含藥血清，用DMEM培養(yǎng)基稀釋，使含藥血清的體積分?jǐn)?shù)達(dá)10%(V/V)[8-9]；將培養(yǎng)好的人肺腺癌A549細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，孵育培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入配制好的不同組別的含藥血清各100 μL，每組平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值(OD)，每組重復(fù)3次,計(jì)算細(xì)胞活力(%)。

細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白調(diào)零組OD)/(空白對(duì)照組OD-空白調(diào)零組OD)×100%

2.5 Western-blot檢測(cè)

顯微鏡下觀察白露湯作用24、48 h后的人肺腺癌A549細(xì)胞活性變化; 收集細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白;采用BCA法測(cè)蛋白濃度;分別加入一抗Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α(1∶500)，于脫色搖床上孵育2 h，TBST液洗膜3次，加入HRP-羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST液洗膜3次，加入發(fā)光劑，去除多余液體，在暗室中用X膠片感光，顯影，定影;采用凝膠成像儀掃描膠片，用Image-Pro Plus軟件分析各條帶的灰度值，將各組Bax、Bcl-2、C-caspase、HIF-1α與其β-actin灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

收集培養(yǎng)的細(xì)胞，藥物作用結(jié)束后，吸除培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，細(xì)胞胰酶消化，離心，去上清，PBS清洗2次，加入PI染液，4℃室溫避光30 min后上機(jī)檢測(cè)，記錄紅色熒光值，每組重復(fù)操作3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞活力的比較

經(jīng)檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組與各濃度含藥血清組的細(xì)胞存活率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。白露湯各濃度給藥組與空白對(duì)照組在24 h、48 h、72 h后比較，人肺腺癌A549細(xì)胞活力逐步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但各濃度含藥血清組之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，低、中、高劑量白露湯含藥血清在24 h、48 h、72 h均對(duì)A549細(xì)胞活力有抑制作用，并且含藥血清濃度越高抑制作用越強(qiáng)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用也逐漸增強(qiáng)。結(jié)果見圖1。

注：與空白對(duì)照組比較，＊P<0.05；與順鉑組比較，＊P<0.05。圖1 各組對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

注：A：空白對(duì)照組；B：順鉑組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組。圖2 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α蛋白表達(dá)

3.2 對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)計(jì)算低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為41.9%、64.9%、73.1%，說明白露湯含藥血清各給藥組均可以不同程度增強(qiáng)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。與空白對(duì)照組比較，各劑量組A549細(xì)胞中的Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α的蛋白表達(dá)均顯著變化(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2/Bax的表達(dá)尤其顯著。各蛋白變化的趨勢(shì)與含藥血清藥物濃度有關(guān)。同時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，白露湯含藥血清各濃度組均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，且隨藥物濃度的增加凋亡的數(shù)目隨之增加。結(jié)果見表1和圖2。

表1 白露湯含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

注：與空白對(duì)照組比較，＊P<0.05。

3.3 對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

與空白對(duì)照組比較，白露湯中、高劑量組含藥血清作用24 h可影響A549細(xì)胞各周期的分布，G0/G1期細(xì)胞比例顯著提高(P<0.05)；S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；G2/M期細(xì)胞比例降低，但無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，白露湯能阻滯A549細(xì)胞周期于G0/G1期，且與劑量濃度正相關(guān)。結(jié)果見表2。

表2 白露湯含藥血清24 h對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

注：與空白對(duì)照組比較，＊P<0.05。

4 討論

非小細(xì)胞肺癌5年的生存率低于15%，大部分以晚期為主[7]。肺癌晚期治療多以放、化療為主，但對(duì)患者可以產(chǎn)生不同程度的毒副作用。研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是細(xì)胞的異常增殖和調(diào)控失控導(dǎo)致的[10-11]。而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是治療腫瘤的關(guān)鍵途徑。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是抗腫瘤的一種重要機(jī)制[12]。Bcl-2家族蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用，一類是Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白，另一類是Bax為代表的促凋亡蛋白。所以，Bcl-2家族蛋白就是凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)[13]。白露湯為清肺解毒藥，中藥復(fù)方的含藥血清是經(jīng)過體內(nèi)吸收代謝的產(chǎn)物，避免了中藥復(fù)方本身因制作工藝產(chǎn)生的干擾和非特異性理化因素對(duì)細(xì)胞作用的假陽(yáng)性，可保證結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。本研究結(jié)果表明，不同濃度的白露湯含藥血清對(duì)A549細(xì)胞的活力均有抑制作用，與藥物濃度、藥物作用時(shí)間相關(guān)；白露湯含藥血清作用A549細(xì)胞的作用是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)、多途徑的。各濃度含藥血清作用A549的24 h后，可顯著影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)，同時(shí)含藥血清中、高劑量組的G2/M期細(xì)胞比例也明顯阻滯[14]。綜上所述，本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，白露湯可抑制人肺癌A549細(xì)胞的活力、影響其細(xì)胞周期、主動(dòng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。并且中醫(yī)藥治療不易產(chǎn)生耐藥性，可調(diào)節(jié)增強(qiáng)肺癌患者的免疫情況，對(duì)肺癌的治療綜合效果良好，但具體的抗腫瘤機(jī)制以及抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)將在后續(xù)繼續(xù)研究。