吳丹，陳晨，劉樹民，叢慧芳，胡蘭銳

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心， 黑龍江 哈爾濱 150040； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

盆腔炎性疾病后遺癥(Sequelae of pelvic inflammatory disease,SPID)屬于盆腔炎性疾病的一種典型遺留病變，既往臨床中將其稱之為慢性盆腔炎，主要典型癥狀可見盆腔黏連、腰骶酸痛以及白帶異常等[1-3]。由于炎癥反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈引起盆腔及周圍組織破壞,出現(xiàn)大面積黏連、增生及瘢痕，進(jìn)而導(dǎo)致臨床中不孕癥、異位妊娠、月經(jīng)不調(diào)及慢性盆腔痛等疾病的發(fā)生。目前，盆腔炎性疾病后遺癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且與盆腔炎性疾病發(fā)作的次數(shù)及嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。嚴(yán)重影響女性身心健康，降低生活質(zhì)量，負(fù)性影響持續(xù)終身[4-5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“血瘀”是本病最終病理結(jié)局[6]，也是“新的致病因素”，所以“因果相干”導(dǎo)致本病纏綿難愈。本研究選用的中藥“紅I號(hào)”是由雞血藤、艾葉、茯苓、牡丹皮、炮姜、赤芍、昆布、桂枝、小茴香和夏枯草10味中草藥組成，治療以“化瘀通絡(luò)”為基本原則，通過直腸給藥的方式，使有效成分與腸道內(nèi)各種分泌物融合，通過腸黏膜，在腸道黏膜免疫屏障把控下，吸收有益物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體大循環(huán)，作用于炎性部位[7-9]。同時(shí)通過藥物改變腸道微生態(tài)，改變腸道菌群分布等方式，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，從而達(dá)到治療盆腔炎性疾病后遺癥的目的,臨床中對于盆腔炎性疾病(PID)的急、慢性期治療，均療效卓著。本研究使用超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF-MS)分析盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)患者糞便譜圖變化，進(jìn)一步探討寒濕瘀滯證SPID的產(chǎn)生機(jī)制和中藥“紅I號(hào)”的臨床作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院收集符合寒濕凝滯證辨證標(biāo)準(zhǔn)的盆腔炎性疾病后遺癥患者28例，及健康自愿者5例。受試者決定是否參加這項(xiàng)研究之前，向其告知可能給帶來的益處、風(fēng)險(xiǎn)和不適，同意者簽署項(xiàng)目知情同意書。納入患者的年齡在18～45周歲，已婚或未婚有性生活史者，患病時(shí)間為3～60個(gè)月之間。將兩組患者年齡、病程及病情程度分級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示治療組與對照組中患者一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。

1.2 藥品制備

中藥“紅I號(hào)”來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院飲片藥局，具體藥物批號(hào)如下：

艾葉10 g(151201)，茯苓15 g(170501)，赤芍15 g(170101)，牡丹皮10 g(170101)，炮姜10 g(170304)，雞血藤10 g(171201)，昆布10 g(171201)，桂枝10 g(170301)，鹽小茴香10 g(170601)和夏枯草10 g(170201)。

1.3 試劑

亮氨酸腦啡肽(L9133，Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色譜級(jí)，Dikma科技公司)；乙腈(色譜級(jí)，Dikma科技公司)。

1.4 儀器

超高液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(Milli-Q公司)。

1.5 分組

盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)患者28例分為5組，d1為病理模型組，d2為用藥第5天，d3為用藥第10天，d4為用藥第15天，d5為用藥第21天，抽提并獲得糞便菌群DNA。

1.6 給藥

將煎好的中藥“紅I號(hào)”灌腸液取藥汁300 mL加熱，待溫度降至39℃～41℃時(shí)，倒入一次性使用灌腸器內(nèi)，患者取側(cè)臥位，臀部抬高10 cm，將一次性灌腸器插入病人肛門約18～20 cm，調(diào)節(jié)滴速，大約20 min滴完。灌腸宜在晚上臨睡前排空二便后進(jìn)行，灌腸結(jié)束后叮囑患者忌即刻排出藥物，盡量保留3～4 h，若能保留至次晨則最好，每晚1次。灌腸每于月經(jīng)干凈后3天開始，連續(xù)用藥20天。

1.7 樣品收集

以月經(jīng)前后20天為治療周期，在無菌操作狀態(tài)下分別取治療第0、5、10、15、20天糞便。糞便凍干研磨，以1∶9的比例與甲醇混合,12 000 rpm，4℃，離心10 min，取上清液，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.8 UPLC-MS分析條件

色譜柱：Waters Acquity SDSLCT Premier；進(jìn)樣量2.00 uL；柱溫40℃，樣品溫度10.0℃。分析條件見表1和表2。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

在Progenesis QI軟件上加載運(yùn)行。首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析(PCA)來檢查聚類分組的情況；再對數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA有監(jiān)督性型分析，評(píng)估每兩組數(shù)據(jù)的差異。S-plot圖中，每個(gè)點(diǎn)代表準(zhǔn)確的質(zhì)量保留時(shí)間，X軸代表變量，紅色的點(diǎn)代表VIP>1且P<0.05的離子，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)代表組間可信度最高的離子。將這些差異化合物重新導(dǎo)入到Progenesis QI軟件中進(jìn)行相關(guān)分析，通過HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物的分類鑒定，最終用Cytoscape3.4.0軟件將獲得的化合物和通路的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化。

表1 UPLC條件

注：Time為時(shí)間；Flow Rate為流速；流動(dòng)相A為含0.1%的甲酸-乙腈溶液；流動(dòng)相B為含0.1%的甲酸-水溶液。

表2 MS條件

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 寒濕瘀滯證SPID患者用藥前后糞便代謝物狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示：空白對照組、模型組、中藥“紅I號(hào)”治療組的糞便具有代表性的BPI圖。由于UPLC色譜柱中的小顆粒填料，小分子代謝物在13 min內(nèi)就能得到很好的分離。

由圖1可知，健康患者與SPID患者代謝譜圖存在明顯差異，表明SPID患者具有獨(dú)特的糞便代謝物特征。

2.2 寒濕瘀滯證SPID給藥后糞便的軌跡

寒濕瘀滯證SPID患者自身用藥后糞便代謝表型的經(jīng)時(shí)軌跡變化，如圖2所示。寒濕瘀滯證SPID患者用藥第20天的糞便代謝表型與其自身對照組(即M)的最遠(yuǎn)，且與空白對照組最近，說明SPID患者給藥后效果顯著。結(jié)果見表2。

圖1 正負(fù)離子模式下空白對照組(A、G)、SPID患者(B、H)和中藥“紅I號(hào)”治療組5 d(C、I),10 d(D、J),15 d(E、K),20 d(F、L)人糞便BPI圖。

注：k：空白對照；m：給藥前；g5：給藥第5天；g10：給藥第10天；g15：給藥第15天；g20：給藥第20天。圖2 中藥“紅I號(hào)”對SPID患者代謝表型的經(jīng)時(shí)軌跡變化

2.3 差異表達(dá)顯示結(jié)果

本文使用OPLS-DA模型中變量重要性投影(Variable importance in the projection，VIP)參數(shù)評(píng)價(jià)潛在糞便表征代謝物譜的生物標(biāo)志物。結(jié)果見圖3。

圖3 正負(fù)離子模式下SPID患者相對正常健康人糞便的S-plots圖(A、B)和VIP-plots(C,D)

圖4 正負(fù)離子模式下SPID患者對正常健康人糞便的S-plots圖(A、B)和VIP-plots(C,D)

由圖3和圖4可知，寒濕瘀滯證SPID給藥前后，糞便代謝物種均存在差異代謝物。圖中選取VIP>1的差異變量，再用t檢驗(yàn)對篩選到的差異變量在對照組和給藥組間進(jìn)行驗(yàn)證，只有P≤0.05的差異變量才被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。

2.4 寒濕瘀滯證SPID患者糞便代謝物中關(guān)鍵標(biāo)志物及相關(guān)通路

由表3可知，在寒濕瘀滯證SPID患者糞便代謝物中，篩選檢測得到8個(gè)具有明顯差異的化合物，其中寒濕瘀滯證SPID患者相對正常健康人糞便中潛在干預(yù)靶點(diǎn)中，4個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)。

表3 SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標(biāo)志物的鑒定

注：與空白組相比，↑為模型組上調(diào)，↓為模型組下調(diào)；Rt-m/z為保留時(shí)間和質(zhì)荷比；HMDB ID為HMDB號(hào)；VIP value為VIP值；Formula為標(biāo)記物分子式；Description為標(biāo)記物英文名稱，KEGG為標(biāo)記物通路。

由圖5和表4可知，將8個(gè)潛在生物標(biāo)志物作為SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標(biāo)志物，并進(jìn)行MetaPA識(shí)別顯著富集通路分析，結(jié)果顯示8個(gè)SPID患者糞便中潛在生物標(biāo)志物參與5個(gè)代謝通路(圖6)，分別是甘油脂代謝、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、類固醇激素生物合成。

表4 SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標(biāo)志物的通路影響

注：1為Glycerolipid metabolism；2為Glycerophospholipid metabolism；3為Arginine and proline metabolism；4為Steroid hormone biosynthesis；5為Galactose metabolism。圖5 基于METPA分析的SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標(biāo)志物拓?fù)鋱D

圖6 基于METPA分析的SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標(biāo)志物拓?fù)鋱D

3 討論

代謝組學(xué)是研究生物體系受刺激或擾動(dòng)后其內(nèi)源性代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的應(yīng)用科學(xué)，通過對內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的無歧視分析，以代謝輪廓、代謝指紋及代謝靶標(biāo)等途徑反映系統(tǒng)生化譜和功能調(diào)節(jié)的整體效果，與強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)效應(yīng)的中醫(yī)藥學(xué)具有天然的趨同性，從而為用生物學(xué)語言表述中醫(yī)藥理論的科學(xué)內(nèi)涵提供了合適的方法。本研究利用UPLC-MS與代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)行中藥“紅I號(hào)”直腸滴入治療后，對盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)多元數(shù)據(jù)分析及潛在生物標(biāo)志物鑒定。通過采集樣品糞便標(biāo)本應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)篩選出關(guān)鍵的生物標(biāo)志物或與疾病有一定相關(guān)性的標(biāo)志物，從而分析藥物的吸收功能、代謝功能以及生物利用度等的影響。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)中藥“紅I號(hào)”藥效是符合整體作用特點(diǎn)的有效方法。本研究初步闡明了盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕凝滯證)患者狀態(tài)下腸道代謝物種微生物的豐度紊亂，中藥“紅I號(hào)”配方干預(yù)后的SPID中物質(zhì)代謝發(fā)生明顯變化，中藥“紅I號(hào)”提取物干預(yù)后，SPID導(dǎo)產(chǎn)生的偏離得到了明顯的改善，闡明表達(dá)中藥“紅I號(hào)”生物學(xué)基礎(chǔ)；同時(shí)，也進(jìn)一步揭示了中藥“紅I號(hào)”及盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)之間存在相關(guān)性，為臨床下一步研究奠定客觀的理論基礎(chǔ)，更為中醫(yī)經(jīng)典理論指導(dǎo)下臨床治療盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)提供了科學(xué)的客觀依據(jù)，更好地推進(jìn)臨床對SPID診治方案的完善和優(yōu)化。