吳丹，陳晨，劉樹民，叢慧芳，胡蘭銳

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心， 黑龍江 哈爾濱 150040； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

盆腔炎性疾病后遺癥(Sequelae of pelvic inflammatory disease,SPID)屬于盆腔炎性疾病的一種典型遺留病變，既往臨床中將其稱之為慢性盆腔炎，主要典型癥狀可見盆腔黏連、腰骶酸痛以及白帶異常等[1-3]。由于炎癥反復發(fā)作，纏綿難愈引起盆腔及周圍組織破壞,出現(xiàn)大面積黏連、增生及瘢痕，進而導致臨床中不孕癥、異位妊娠、月經(jīng)不調(diào)及慢性盆腔痛等疾病的發(fā)生。目前，盆腔炎性疾病后遺癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且與盆腔炎性疾病發(fā)作的次數(shù)及嚴重程度呈正相關。嚴重影響女性身心健康，降低生活質(zhì)量，負性影響持續(xù)終身[4-5]。中醫(yī)學認為“血瘀”是本病最終病理結局[6]，也是“新的致病因素”，所以“因果相干”導致本病纏綿難愈。本研究選用的中藥“紅I號”是由雞血藤、艾葉、茯苓、牡丹皮、炮姜、赤芍、昆布、桂枝、小茴香和夏枯草10味中草藥組成，治療以“化瘀通絡”為基本原則，通過直腸給藥的方式，使有效成分與腸道內(nèi)各種分泌物融合，通過腸黏膜，在腸道黏膜免疫屏障把控下，吸收有益物質(zhì)進入機體大循環(huán)，作用于炎性部位[7-9]。同時通過藥物改變腸道微生態(tài)，改變腸道菌群分布等方式，改善機體內(nèi)環(huán)境，從而達到治療盆腔炎性疾病后遺癥的目的,臨床中對于盆腔炎性疾病(PID)的急、慢性期治療，均療效卓著。本研究使用超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF-MS)分析盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)患者糞便譜圖變化，進一步探討寒濕瘀滯證SPID的產(chǎn)生機制和中藥“紅I號”的臨床作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院收集符合寒濕凝滯證辨證標準的盆腔炎性疾病后遺癥患者28例，及健康自愿者5例。受試者決定是否參加這項研究之前，向其告知可能給帶來的益處、風險和不適，同意者簽署項目知情同意書。納入患者的年齡在18～45周歲，已婚或未婚有性生活史者，患病時間為3～60個月之間。將兩組患者年齡、病程及病情程度分級進行統(tǒng)計學分析，結果顯示治療組與對照組中患者一般資料差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性(P>0.05)。

1.2 藥品制備

中藥“紅I號”來源于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院飲片藥局，具體藥物批號如下：

艾葉10 g(151201)，茯苓15 g(170501)，赤芍15 g(170101)，牡丹皮10 g(170101)，炮姜10 g(170304)，雞血藤10 g(171201)，昆布10 g(171201)，桂枝10 g(170301)，鹽小茴香10 g(170601)和夏枯草10 g(170201)。

1.3 試劑

亮氨酸腦啡肽(L9133，Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色譜級，Dikma科技公司)；乙腈(色譜級，Dikma科技公司)。

1.4 儀器

超高液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；KDC-160HR高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(Milli-Q公司)。

1.5 分組

盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)患者28例分為5組，d1為病理模型組，d2為用藥第5天，d3為用藥第10天，d4為用藥第15天，d5為用藥第21天，抽提并獲得糞便菌群DNA。

1.6 給藥

將煎好的中藥“紅I號”灌腸液取藥汁300 mL加熱，待溫度降至39℃～41℃時，倒入一次性使用灌腸器內(nèi)，患者取側臥位，臀部抬高10 cm，將一次性灌腸器插入病人肛門約18～20 cm，調(diào)節(jié)滴速，大約20 min滴完。灌腸宜在晚上臨睡前排空二便后進行，灌腸結束后叮囑患者忌即刻排出藥物，盡量保留3～4 h，若能保留至次晨則最好，每晚1次。灌腸每于月經(jīng)干凈后3天開始，連續(xù)用藥20天。

1.7 樣品收集

以月經(jīng)前后20天為治療周期，在無菌操作狀態(tài)下分別取治療第0、5、10、15、20天糞便。糞便凍干研磨，以1∶9的比例與甲醇混合,12 000 rpm，4℃，離心10 min，取上清液，進行質(zhì)譜分析。

1.8 UPLC-MS分析條件

色譜柱：Waters Acquity SDSLCT Premier；進樣量2.00 uL；柱溫40℃，樣品溫度10.0℃。分析條件見表1和表2。

1.9 統(tǒng)計學分析處理

在Progenesis QI軟件上加載運行。首先對數(shù)據(jù)進行無監(jiān)督的主成分分析(PCA)來檢查聚類分組的情況；再對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA有監(jiān)督性型分析，評估每兩組數(shù)據(jù)的差異。S-plot圖中，每個點代表準確的質(zhì)量保留時間，X軸代表變量，紅色的點代表VIP>1且P<0.05的離子，離原點越遠代表組間可信度最高的離子。將這些差異化合物重新導入到Progenesis QI軟件中進行相關分析，通過HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫進行化合物的分類鑒定，最終用Cytoscape3.4.0軟件將獲得的化合物和通路的網(wǎng)絡圖進行可視化。

表1 UPLC條件

注：Time為時間；Flow Rate為流速；流動相A為含0.1%的甲酸-乙腈溶液；流動相B為含0.1%的甲酸-水溶液。

表2 MS條件

2 實驗結果

2.1 寒濕瘀滯證SPID患者用藥前后糞便代謝物狀態(tài)

實驗結果如圖1所示：空白對照組、模型組、中藥“紅I號”治療組的糞便具有代表性的BPI圖。由于UPLC色譜柱中的小顆粒填料，小分子代謝物在13 min內(nèi)就能得到很好的分離。

由圖1可知，健康患者與SPID患者代謝譜圖存在明顯差異，表明SPID患者具有獨特的糞便代謝物特征。

2.2 寒濕瘀滯證SPID給藥后糞便的軌跡

寒濕瘀滯證SPID患者自身用藥后糞便代謝表型的經(jīng)時軌跡變化，如圖2所示。寒濕瘀滯證SPID患者用藥第20天的糞便代謝表型與其自身對照組(即M)的最遠，且與空白對照組最近，說明SPID患者給藥后效果顯著。結果見表2。

圖1 正負離子模式下空白對照組(A、G)、SPID患者(B、H)和中藥“紅I號”治療組5 d(C、I),10 d(D、J),15 d(E、K),20 d(F、L)人糞便BPI圖。

注：k：空白對照；m：給藥前；g5：給藥第5天；g10：給藥第10天；g15：給藥第15天；g20：給藥第20天。圖2 中藥“紅I號”對SPID患者代謝表型的經(jīng)時軌跡變化

2.3 差異表達顯示結果

本文使用OPLS-DA模型中變量重要性投影(Variable importance in the projection，VIP)參數(shù)評價潛在糞便表征代謝物譜的生物標志物。結果見圖3。

圖3 正負離子模式下SPID患者相對正常健康人糞便的S-plots圖(A、B)和VIP-plots(C,D)

圖4 正負離子模式下SPID患者對正常健康人糞便的S-plots圖(A、B)和VIP-plots(C,D)

由圖3和圖4可知，寒濕瘀滯證SPID給藥前后，糞便代謝物種均存在差異代謝物。圖中選取VIP>1的差異變量，再用t檢驗對篩選到的差異變量在對照組和給藥組間進行驗證，只有P≤0.05的差異變量才被認為是潛在的生物標志物。

2.4 寒濕瘀滯證SPID患者糞便代謝物中關鍵標志物及相關通路

由表3可知，在寒濕瘀滯證SPID患者糞便代謝物中，篩選檢測得到8個具有明顯差異的化合物，其中寒濕瘀滯證SPID患者相對正常健康人糞便中潛在干預靶點中，4個上調(diào)，4個下調(diào)。

表3 SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標志物的鑒定

注：與空白組相比，↑為模型組上調(diào)，↓為模型組下調(diào)；Rt-m/z為保留時間和質(zhì)荷比；HMDB ID為HMDB號；VIP value為VIP值；Formula為標記物分子式；Description為標記物英文名稱，KEGG為標記物通路。

由圖5和表4可知，將8個潛在生物標志物作為SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標志物，并進行MetaPA識別顯著富集通路分析，結果顯示8個SPID患者糞便中潛在生物標志物參與5個代謝通路(圖6)，分別是甘油脂代謝、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、類固醇激素生物合成。

表4 SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標志物的通路影響

注：1為Glycerolipid metabolism；2為Glycerophospholipid metabolism；3為Arginine and proline metabolism；4為Steroid hormone biosynthesis；5為Galactose metabolism。圖5 基于METPA分析的SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標志物拓撲圖

圖6 基于METPA分析的SPID患者相對正常健康人糞便中潛在生物標志物拓撲圖

3 討論

代謝組學是研究生物體系受刺激或擾動后其內(nèi)源性代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的應用科學，通過對內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的無歧視分析，以代謝輪廓、代謝指紋及代謝靶標等途徑反映系統(tǒng)生化譜和功能調(diào)節(jié)的整體效果，與強調(diào)系統(tǒng)效應的中醫(yī)藥學具有天然的趨同性，從而為用生物學語言表述中醫(yī)藥理論的科學內(nèi)涵提供了合適的方法。本研究利用UPLC-MS與代謝組學技術相結合，進行中藥“紅I號”直腸滴入治療后，對盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)多元數(shù)據(jù)分析及潛在生物標志物鑒定。通過采集樣品糞便標本應用代謝組學技術篩選出關鍵的生物標志物或與疾病有一定相關性的標志物，從而分析藥物的吸收功能、代謝功能以及生物利用度等的影響。應用代謝組學技術評價中藥“紅I號”藥效是符合整體作用特點的有效方法。本研究初步闡明了盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕凝滯證)患者狀態(tài)下腸道代謝物種微生物的豐度紊亂，中藥“紅I號”配方干預后的SPID中物質(zhì)代謝發(fā)生明顯變化，中藥“紅I號”提取物干預后，SPID導產(chǎn)生的偏離得到了明顯的改善，闡明表達中藥“紅I號”生物學基礎；同時，也進一步揭示了中藥“紅I號”及盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)之間存在相關性，為臨床下一步研究奠定客觀的理論基礎，更為中醫(yī)經(jīng)典理論指導下臨床治療盆腔炎性疾病后遺癥(寒濕瘀滯證)提供了科學的客觀依據(jù)，更好地推進臨床對SPID診治方案的完善和優(yōu)化。