周紅敏,周淑娟
(鄭州市第六人民醫(yī)院,河南 鄭州 450015)
月季花為薔薇科植物月季(RosachinensisJacq.)的花蕾和初開放的花,遍布我國大部分地區(qū)。月季花具有很高的觀賞價值,也具有很高的藥用價值,其性味甘、溫,主入肝經,具有活血調經、消腫解毒的功效,臨床內服可用于治療月經不調、經閉、痛經,外敷治療癰癤腫毒、瘰疬、跌仆瘀腫。何英萍[1]總結相關治療月經不調經驗方發(fā)現,月季花3~5朵、黃酒10 g、冰糖適量加水煎服具有行氣活血的功效,適用于氣滯血瘀所致閉經、痛經等癥。月季花中含有多種化合物,如槲皮素、山奈黃素、鼠李糖苷、胡桃苷等,主要含黃酮和酚酸類化合物,同時也是其主要活性成分[2]。近現代藥理學研究表明,月季花具有很強的抗菌、抗病毒、抗氧化作用。袁克星等[3]探討月季花色素對小鼠運動能力及抗氧化能力的影響,發(fā)現月季花色素可顯著增強小鼠體內多種抗氧酶的活性,提高小鼠運動能力。有文獻報道,月季花可抑制腫瘤,具有抗癌作用,同時對增強機體免疫也有顯著作用[4]。本實驗通過對小鼠反復腦缺血再灌注模型小鼠腦組織勻漿中NO、NOS水平,以及血清中NSE和腦組織含水量的檢測,探討月季花總黃酮對小鼠腦缺血后可能的作用機制。
月季花總黃酮:含量(總黃酮)50%,由鄭州大學實驗中心提供;腦絡通膠囊由四川泰華堂制藥有限公司提供。
KM小鼠,雄性,SPF級,24~26 g,由河南省實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(豫)2015-0001。
UV1000單光束紫外/可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司);玻璃勻漿器(鄭州玻璃儀器廠);可調式移液器(上海雷勃分析儀器有限公司);KDC-160HR高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱(上?;|試驗儀器設備有限公司)。
羧甲基纖維素鈉(天津市福晨化學試劑廠);神經元烯醇化酶(NSE)ELISA檢測試劑盒(北京誠林生物科技有限公司);一氧化氮(NO)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒、考馬斯亮藍蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)。
取KM雄性小鼠84只,SPF級,實驗室適應性飼養(yǎng)3天,稱重隨機分為6組,即假手術組、模型組、腦絡通組(0.75 g/kg)和月季花總黃酮組高、中、低劑量組(0.4 g/kg、0.2 g/kg、0.1 g/kg),除假手術和模型組外,其余各組給予相應藥物,1天1次,連續(xù)給藥7 d,于第6 d晚八點禁食不禁水12 h,第7 d早給藥1 h后進行手術,制造小鼠反復再灌注模型。10%水合氯醛小鼠腹腔注射麻醉(0.35 g/kg),并仰臥固定于鼠板上,頸部剃毛酒精消毒后正中切口,精密分離雙側頸總動脈(CCA)周圍肌肉和神經,穿線備用。用微動脈夾同時夾閉雙側CCA 10 min后,松開微動脈夾,使小鼠腦部恢復供血10 min,再進行第二次夾閉阻斷血流10 min,再松開,給予適量青霉素,縫合傷口,于第8 d早上給藥1 h后進行取材。注意實驗室溫度控制在25℃左右,假手術組僅分離雙側CCA但不阻斷血流[5]。
1.6.1 血清的制備
各組小鼠缺血再灌注22 h后進行摘眼球取血,靜置1 h待血液分層,低溫離心10 min,3 500 r/min,移液槍取上層血清冷凍備用,測定血清中NSE水平。
1.6.2 腦勻漿的制備
取血后小鼠脫頸椎處死,迅速剝腦,按矢狀線將小鼠腦組織分為兩半,切除小腦和嗅球。取其中一半,用冰生理鹽水沖凈腦組織表面血液,濾紙沾干,精確稱取腦組織重量,加入9倍生理鹽水充分勻漿,制成10%腦組織勻漿液,低溫離心10 min,3 000 r/min,移液槍取上清液冷凍備用,測定腦勻漿中NO、NOS水平。
1.6.3 腦組織含水量測定
取另一半腦組織,沖凈表面血跡,濾紙沾干后精密稱重,為腦組織重量A(濕重),將腦組織置于105℃烘箱中連續(xù)烘干48 h置恒重,即為重量B(干重),運用公式計算腦組織含水量[6]。
腦組織含水量(%)=(A-B)/A×100%
除假手術組外,術后其余各組均呈現出不同程度死亡現象。其中,模型組死亡率最高,為28.57%,且模型組動物不同程度出現神經癥狀缺失現象,精神萎靡,不活躍,甚至出現走路傾倒或意識喪失等現象;陽性藥腦絡通組相較于模型組,動物術后狀態(tài)得到大幅度改善,并且死亡率僅為14.29%;月季花總黃酮各組對小鼠不論是術后狀態(tài)還是死亡率,均有不同的改善作用,其中以月季花總黃酮高劑量組效果最好,死亡率降低至10%以下,且術后動物較為活躍,狀態(tài)比模型組有很大提升。結果見表1。
表1 各組對小鼠反復腦缺血再灌注模型死亡率的影響
由表2可得,與假手術組相比,模型組小鼠血清中NSE含量大幅升高(P<0.01),說明小鼠反復缺血再灌注模型造模成功。與模型組相比,陽性藥腦絡通組可顯著下調小鼠血清中NSE水平(P<0.01),有明顯改善作用;月季花總黃酮高劑量組可顯著降低小鼠血清中NSE含量(P<0.01),中劑量和低劑量可明顯降低小鼠血清中NSE含量(P<0.05),說明月季花總黃酮可改善小鼠缺血損傷后血清中NSE水平,高劑量月季花總黃酮效果最佳。
表2 各組對小鼠反復腦缺血再灌注模型血清中NSE含量的影響
注:與假手術組相比,##P<0.01;與模型組相比,**P<0.01,*P<0.05。
由表3可得,與假手術組相比,模型組小鼠腦組織勻漿中NO含量大幅增加,NOS的活性也大幅上調(P<0.01),提示小鼠反復缺血再灌注模型造模成功。與模型組相比,陽性藥腦絡通組可顯著降低小鼠腦組織中NO的水平(P<0.01)、顯著下調NOS活性(P<0.01);月季花總黃酮各組對NO、NOS也有明顯的改善作用,其中高劑量可顯著降低腦組織勻漿中NO、NOS水平(P<0.01),中劑量組可明顯降低腦組織勻漿中NO、NOS水平(P<0.05),低劑量組可明顯降低NOS活性(P<0.05),對腦組織中NO含量有明顯降低趨勢,但無統(tǒng)計學意義。
由表4可得,與假手術組相比,模型組小鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.01),提示造模成功。陽性藥腦絡通組可顯著降低缺血損傷后小鼠腦組織含水量(P<0.01),月季花總黃酮各組對腦組織含水量有明顯改善作用,其中高劑量組和中劑量組可降低小鼠腦組織含水量(P<0.05),低劑量組降低趨勢明顯,但無統(tǒng)計學意義。結果見表4。
表3 各組對小鼠反復腦缺血再灌注模型腦組織勻漿中NO、NOS水平的影響
注:與假手術組相比,##P<0.01;與模型組相比,**P<0.01,*P<0.05。
表4 各組對小鼠反復腦缺血再灌注模型腦組織含水量的影響
注:與假手術組相比,##P<0.01;與模型組相比,**P<0.01,*P<0.05。
腦血管病(CVD)是當今危害人類生命健康的第三主要原因,僅次于心臟病和惡性腫瘤相關疾病,根據其發(fā)病的差異性,可分為缺血性和出血性兩種[7]。劉瑛娜等[8]通過對兩種不同性質腦卒中的發(fā)病情況進行統(tǒng)計分析,腦卒中的發(fā)病與年齡、季候有很大關系,40歲以上隨年齡增加缺血性腦卒中呈上升趨勢,夏季缺血性卒中發(fā)病率較高,但總體來說,缺血性腦卒中患病約占腦卒中的七成,如何更好的防治缺血性腦血管疾病是如今CVD研究的重點,本實驗通過月季花總黃酮對小鼠反復缺血再灌注模型的作用,探討月季花總黃酮在防治腦缺血疾病的可能機制。
神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是神經系統(tǒng)特異性蛋白質,含量由高到低依次為腦、脊髓和周圍神經節(jié)。正常情況下,細胞間質和血液中NSE的水平非常低,在缺血缺氧后,腦組織能量代謝降低,神經元損傷或壞死,NSE從胞內釋放,透過血腦屏障進入血液,使血液中NSE含量大幅上調,因此,通過檢測血清中NSE含量,能間接判斷缺血后腦組織損傷程度,可作為簡易血清生物學標志物[9]。實驗結果顯示,小鼠反復缺血再灌注手術后,模型組小鼠腦組織勻漿中NSE含量大幅升高(P<0.01),具有極顯著性,月季花各給藥組可明顯降低腦組織NSE含量,說明小鼠反復腦缺血后,月季花總黃酮對神經元可能有保護作用,改善神經元損傷及壞死,減少NSE從胞內釋放,血清中含量顯著降低,其中高劑量月季花總黃酮組效果較好。
目前,腦缺血的機制大致有能量代謝障礙、自由基反應、炎癥級聯反應、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載等,而NO和NOS在腦缺血損傷中的作用和機制也越發(fā)引起關注。經研究,NO是機體中重要的信使和效應分子,參與機體生理病理活動。在腦缺血發(fā)生后,根據產生NO細胞的類型和產生過程條件的不同,NO發(fā)揮保護和損傷的雙重作用[10]。
在腦缺血損傷過程中,NO和NOS主要起神經毒性的作用。在腦缺血缺氧早期,eNOS活性上調,產生的NO可擴張腦血管,增加腦組織血流量,發(fā)揮保護作用[11],但這種保護作用僅在數小時短時間內,隨著缺血程度的不斷加深,iNOS在中晚期大量表達,起到神經毒性作用[12]。腦缺血后通過抑制NO和NOS,可改善腦組織的損傷以及神經細胞凋亡[13]。由實驗結果可得,在小鼠反復腦缺血再灌注22 h后,模型組小鼠腦組織中NO、NOS水平均大幅升高(P<0.01),產生的大量NO以及NOS活性上調,均會加重缺血損傷,月季花總黃酮各組具有明顯降低腦組織中NO和NOS水平的趨勢,由此可推斷,月季花總黃酮可能通過降低NO和NOS水平來減輕缺血缺氧后腦組織神經毒性作用,對神經細胞起到保護作用。
腦缺血再灌注時,產生大量炎癥因子和自由基,興奮性氨基酸、細胞鈣離子超載、血管活性物質作用等均可造成腦組織水腫,腦組織含水量可反映腦水腫程度[14],同時也可反映藥物對腦缺血再灌注損傷的保護作用[6]。由實驗結果得,與假手術組相較,模型組腦組織含水量大幅升高(P<0.01),說明小鼠腦缺血術后組織水腫嚴重,月季花總黃酮對小鼠腦水腫有很好的改善作用,有明顯減低的趨勢,提示月季花總黃酮可通過改善腦水腫對小鼠腦缺血起到保護作用,以月季花總黃酮高劑量組效果最佳。
綜上,月季花總黃酮可以顯著降低小鼠反復再灌注模型血清中NSE含量、腦組織勻漿中NO和NOS水平、減輕缺血后腦水腫,對腦缺血起到改善作用,以高劑量效果最佳。