蒙縝之 廖美愛 李婷 梁舒婷 鄧凱戈 潘鳳婷 王凌風 尚鵬飛 黃彥峰 黃俊杰
鋁元素廣泛存在于自然界,由于其良好的理化性質(zhì)而被廣泛應用于各個領域。隨著人類接觸和使用鋁的情況日益增多,一定程度上增加了鋁在人體的蓄積。鋁是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì),長期接觸鋁可引起學習記憶功能減退、認知功能障礙等癥狀[1,2],然而鋁中毒損傷學習記憶的機制尚未完全明確。本研究擬通過檢測鋁中毒小鼠大腦皮層乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)和β-內(nèi)啡肽(β-endorphin,β-EP)的含量,探討大腦皮層ACh和β-EP在鋁中毒機制中的作用,為闡明鋁的神經(jīng)毒性機制和后續(xù)的干預研究提供理論依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠32只,12周齡,體重20~25g,購自右江民族醫(yī)學院實驗動物中心[動物合格證號:SCXK(桂)2012-0003],雌雄分籠飼養(yǎng),每籠8只。
1.1.2 主要實驗試劑及儀器 三氯化鋁(AlCl3,天津市大茂化學試劑廠),乙酰膽堿試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);小鼠內(nèi)啡肽試劑盒(Sigma 公司)。FSH-2可調(diào)高速勻漿機(江蘇省金壇市宏華儀器廠),Y 型迷宮刺激器(MG-B,張家港市教學實驗器械廠),小型離心機(上海安亭科學儀器廠),大型離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 分組建模 取小鼠32 只,雌雄各半,隨機分成低、中、高劑量染毒組和對照組,每組8 只。低、中、高劑量組用16g/L 濃度的AlCl3水溶液,每日分別按1.2mg/kg、12mg/kg、120mg/kg 劑量,拌飼料喂養(yǎng),直至實驗結(jié)束,連續(xù)90d;對照組普通飼料正常飼養(yǎng)。
1.2.2 小鼠學習記憶能力測試 小鼠的學習和記憶行為能力用Y型迷宮刺激器進行檢測。Y型迷宮由3只短臂組成,以小鼠所在短臂為起步區(qū),另兩只短臂中隨機選擇一只為安全區(qū),一只為非安全區(qū)。安全區(qū)燈泡開亮,銅柵無電流;起步區(qū)和非安全區(qū)燈泡不亮,銅柵有電流。控制開關打開后,安全區(qū)燈光立刻亮起,起步區(qū)和非安全區(qū)延遲2s后通電。若小鼠在燈光亮起時能成功逃向安全區(qū),則記為“正確”,否則記為“錯誤”。按文獻[3,4]的實驗方法和標準,將小鼠達到學會標準時所需的測試次數(shù),作為大鼠學習行為能力的檢測指標。學習能力檢測24h后,依照上述方法對小鼠連續(xù)進行20 次測試,記錄大鼠在20次測試中的錯誤次數(shù),作為小鼠記憶行為能力的檢測指標。
1.2.3 樣本采集及制備方法 動物斷頭處死,在冰臺上快速取大腦皮層,一半大腦皮層放入-80℃冰箱保存,送廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心,用于測定小鼠大腦皮層鋁含量。另一半大腦皮層,用冰生理鹽水漂洗置于濾紙吸干,切取組織塊0.4g,置于勻漿試管中,加入生理鹽水3.6ml后進行勻漿,離心(3 500r/min)10min,取上清液,制成10%的勻漿4℃冰箱保存待測。
1.2.4 大腦皮層主要觀察指標 用微波消解-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)法[5]測定大腦皮層鋁的含量;ELISA法檢測大腦皮層ACh和β-EP含量;用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。測試步驟嚴格按試劑盒說明書進行。
1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,各組均數(shù)間的差異性采用單因素方差分析比較,兩兩組間比較采用LSD法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 一般情況低劑量染毒組和對照組小鼠均活潑好動,飲食無明顯改變,毛色較光亮;中、高劑量染毒組小鼠活動減少,進食量減少,毛發(fā)蓬松少光澤。
2.2 小鼠Y 型迷宮實驗學習和記憶檢測結(jié)果Y型迷宮實驗結(jié)果顯示:各組間學習測試次數(shù)和記憶錯誤次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比,中、高劑量鋁中毒組學習測試次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與低劑量組相比,中、高劑量組學習測試次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比,低、中、高劑量鋁中毒組記憶錯誤次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);與低劑量組相比,中、高劑量組記憶錯誤次數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。
表1 小鼠Y型迷宮學習和記憶檢測結(jié)果(±s,n=8)
表1 小鼠Y型迷宮學習和記憶檢測結(jié)果(±s,n=8)
注:與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與低劑量組比較,cP<0.01,dP<0.05
組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組學習測試次數(shù)15.13±1.64 17.00±1.31 20.13±2.30bc 22.25±2.71bc記憶錯誤次數(shù)4.25±1.04 5.88±1.36a 7.88±1.46bd 10.88±2.23bc
2.3 小鼠大腦皮層鋁、ACh 和β-EP 含量各組間大腦皮層鋁、ACh、β-EP 含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)。與對照組相比,中、高劑量鋁中毒組大腦皮層鋁含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);與低劑量組相比,中、高劑量組大腦皮層鋁含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與對照組相比,中、高劑量組大腦皮層ACh 含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);與低劑量組相比,高劑量組大腦皮層ACh含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比,低、中、高劑量組大腦皮層β-EP含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);與低劑量組相比,高劑量組大腦皮層β-EP 含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。
表2 小鼠大腦皮層鋁、ACh和β-EP含量測定結(jié)果(±s,n=8)
表2 小鼠大腦皮層鋁、ACh和β-EP含量測定結(jié)果(±s,n=8)
注:與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與低劑量組比較,cP<0.05,dP<0.01
組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組鋁(mg/kg)48.96±9.25 52.21±12.20 63.65±11.69ac 76.95±11.17bd ACh(μg/mg prot)9.92±2.28 8.24±1.72 7.58±2.15a 4.79±1.31bd β-EP(pg/ml)45.16±6.47 39.58±2.65a 36.17±7.81b 33.98±2.50bc
研究表明ACh 是中樞膽堿能系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì),是由膽堿能神經(jīng)元產(chǎn)生的化學遞質(zhì),膽堿能系統(tǒng)與學習記憶的形成和存儲有關[6,7]。β-EP是腦組織內(nèi)具有嗎啡樣活性的多肽,屬于內(nèi)源性阿片樣物質(zhì),相關研究表明,血管性癡呆模型大鼠腦組織及血漿β-EP含量降低,并且其降低程度與癡呆程度密切相關[8,9]。有研究表明[10,11],鋁可導致大鼠學習記憶能力下降,認為可能與大鼠海馬AMPA 受體蛋白表達水平下降、海馬內(nèi)CaN 的表達增加、全基因組甲基化率降低等有關,但其確切機制有待進一步研究。鋁中毒引起的學習記憶障礙是否與腦內(nèi)ACh和β-EP含量有關尚未明確。
本研究以飼喂含不同劑量AlCl3的飼料對小鼠染毒90d 后顯示:鋁暴露組Y 型迷宮實驗學習訓練次數(shù)和錯誤次數(shù)均高于對照組,且高劑量組這兩項指標比低、中劑量組均升高,這說明鋁中毒可致小鼠學習記憶能力下降。小鼠大腦皮層鋁含量測定結(jié)果也顯示,各劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層鋁含量均高于對照組,且不同劑量組大腦皮層鋁含量比較也有差異,鋁中毒組大腦皮層鋁含量增高,小鼠學習測試次數(shù)和記憶錯誤次數(shù)均增加,這與文獻報道[12,13]一致,提示不同劑量鋁暴露組引起大腦鋁蓄積,導致小鼠學習記憶功能障礙。本研究結(jié)果還顯示,各劑量鋁中毒組大腦皮層鋁含量增高,小鼠學習測試次數(shù)和記憶錯誤次數(shù)也增加的同時,其大腦皮層ACh和β-EP含量反而明顯低于對照組,且大腦皮層內(nèi)鋁含量越高,小鼠學習記憶能力下降越明顯,大腦內(nèi)ACh和β-EP也隨之明顯下降,呈現(xiàn)一定的劑量效應關系,提示鋁可能通過降低腦內(nèi)ACh和β-EP的含量影響小鼠學習記憶能力,這可能是鋁致小鼠認知能力障礙的機制之一,但其具體機制還有待進一步研究。