高偉華，劉 鷺，王 芬，逄曉陽，張書文，蘆 晶，段江燕,*，呂加平,*

（1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.北京市營養(yǎng)源研究所，系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術(shù)研究中心，北京 100069）

糖尿病是全球威脅人類健康的一種慢性非傳染性疾病[1]，世界衛(wèi)生組織（2011年發(fā)表的《全球非傳染性疾病報告》顯示，目前全球的糖尿病患者人數(shù)已經(jīng)達到了3.46 億。糖尿病主要特點表現(xiàn)為胰島素絕對或相對不足引起血糖水平升高，同時常伴有脂肪代謝紊亂，進而出現(xiàn)高血脂[2-3]。因此預(yù)防和治療高血脂是防治糖尿病的關(guān)鍵措施[4]，現(xiàn)有的大多降脂藥物如血脂康和辛伐他汀等能有效降低高脂血癥發(fā)病的危險性[5]，但此類藥物會產(chǎn)生惡心、腹瀉等胃腸道疾病的副作用[6]，不宜長期服用。因此，尋求療效顯著、安全可靠的調(diào)血脂膳食一直是科研發(fā)展方向之一。

乳酸菌作為一種益生菌具有許多重要的生理功能[7]，可以調(diào)節(jié)胃腸道菌群、提高免疫、消除人體自由基、預(yù)防癌癥等[8]，除此之外還具有降低食物及人體血清中膽固醇含量、降低心血管病發(fā)病率的作用[9-12]。有研究證明在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型中，通過給予雙歧桿菌和乳桿菌可以有效降低血清膽固醇和甘油三酯水平[13]。近年來，乳酸菌作為一種安全的膳食補充劑，研究其對糖尿病引發(fā)的糖脂代謝異常及對機體炎癥反應(yīng)的影響已經(jīng)在國內(nèi)外引起極大的重視[14-16]。本研究利用高糖高脂聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)小鼠患糖尿病，并對其進行乳酸菌菌液的灌胃，分析與血脂代謝相關(guān)指標(biāo)水平的變化，旨在揭示乳酸菌對2型糖尿病小鼠糖脂代謝的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4～5 周齡雄性BALB/c小鼠，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，許可證號：SYXK（京）2013-0023。

菌株Lactobacillus casei D6、L. casei D36、L. casei D18、L. casei D30、L. casei SY13（均分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品）L. rhamnosus LGG均由本實驗室保藏。

MRS培養(yǎng)基 北京路橋技術(shù)股份有限公司；STZ美國Sigma公司；膽固醇、牛膽鹽、總膽固醇檢測試劑盒北京大宏利輝生物科技中心；胰島素、內(nèi)毒素、肝糖原、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、糖化血紅蛋白、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol總RNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；PrimeScript? RT reagent及SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒 寶生物有限公司。引物由北京Invitrogen公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

QL-902漩渦振蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Centrifuge 5415D高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000分光光度計 美國Thermo Scientif i c公司；RM 2235石蠟切片機 德國Leica公司；1600凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；ABI7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 降膽固醇乳酸菌初篩

將實驗室保藏的6 株乳酸菌活化培養(yǎng)，按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h備用。膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活性被認為是降低膽固醇的關(guān)鍵因素[17-19]，利用膽鹽解離結(jié)合高效液相色譜法檢測乳酸菌BSH活力，得到膽鹽出峰面積圖，出峰總面積對應(yīng)膽鹽濃度，利用空白對照計算出菌體膽鹽濃度，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出菌體蛋白濃度。一個BSH活力單位被定義為每分鐘催化1 mol底物水解所需的酶量[20]。

1.3.2 降膽固醇乳酸菌的復(fù)篩

1.3.2.1 菌株耐酸性篩選

參考郭均[21]的方法將初篩得到的具有較強BSH活性的菌株按體積分?jǐn)?shù)4%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，3 000hg、4 ℃離心10 min收集菌體，將菌體分別懸浮于pH 2.0、4.0、6.0的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng) 3 h后取樣測定OD600nm，以固有pH 7.3的MRS培養(yǎng)基作為對照，按式（1）計算菌株耐酸存活率。

式中：Nt為低pH值MRS培養(yǎng)3 h 后的存活菌數(shù)；No為固有pH 7.3的MRS培養(yǎng)3 h后的存活菌數(shù)。

1.3.2.2 菌株耐膽鹽篩選

參考Dunne等[22]的方法將初篩得到的具有較強BSH活性的菌株按體積分?jǐn)?shù)4%接種量接種于含0.3 g/100 mL膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h，以未添加膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對照組。傾注平板于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，按式（2）計算菌株的耐膽鹽存活率。

式中：Nt為添加膽鹽樣品的菌落數(shù)；No為未添加膽鹽樣品的菌落數(shù)。

1.3.3 菌液制備及計數(shù)

將上述篩選出的兩株乳酸菌進行批量發(fā)酵，以體積分?jǐn)?shù)5%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)完成后先取少量菌液進行鏡檢，確定無雜菌污染后于3 000hg、4 ℃離心20 min收集菌體，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%L-谷氨酸-脫脂乳進行冷凍干燥，然后將菌粉進行活菌計數(shù)，灌胃小鼠前用0.85%生理鹽水重懸菌粉使其濃度為1h1010CFU/mL。

1.3.4 實驗動物模型建立及分組

4～5 周齡雄性BALB/c小鼠100 只，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF級動物房，室內(nèi)溫度（22f2）℃、相對濕度60%，晝夜明暗交替12 h/12 h，自由飲水取食。

實驗采用預(yù)防性飼喂，即造模同時飼喂菌液，造模方式采用高脂飼料聯(lián)用小劑量STZ注射，STZ溶于檸檬酸緩沖液，現(xiàn)用現(xiàn)配，注射劑量為40 mg/kg，每天1 次，連續(xù)3 d，正常對照組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%的生理鹽水代替。用基礎(chǔ)飼料（12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）脂肪、65%碳水化合物、22%蛋白質(zhì)）將上述Balb/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為4 組（每組25 只）：正常對照組（N）、模型組（M）、SY13菌組（SY13）、36號菌組（D36），除正常對照組飼喂基礎(chǔ)飼料外，其余各組每天飼喂高脂飼料（46%脂肪、38%碳水化合物、16%蛋白質(zhì)），菌液灌胃組飼喂菌液（劑量為1h1010CFU/只），模型組用生理鹽水代替（表1）。造模從第2周開始，連續(xù)造模6 周。實驗期間所有小鼠自由飲水取食，每周定時稱量體質(zhì)量和采食量。

表1 實驗動物分組Table1 Grouping of experimental animals

1.3.5 組織取材及處理

組織取材及處理參考文獻[23]。分別在喂養(yǎng)第6、10周和14周時，處死每組中一定數(shù)量的小鼠（第6、10周分別處死8 只，第14周處死9 只）。處死小鼠隔夜禁食，自由飲水，摘眼球取血，全血靜置后于4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清并凍存于－80 ℃?zhèn)溆?。脫頸處死小鼠后，分別摘取肝臟、胰腺及附睪脂肪組織，取出部分肝臟組織加入預(yù)冷的生理鹽水制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝臟勻漿液，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液置于－80 ℃保存?zhèn)溆?，胰腺組織用體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛溶液固定保存?zhèn)錂z，附睪脂肪組織凍存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 指標(biāo)測定

1.3.6.1 體質(zhì)量與空腹血糖濃度

實驗期間，每周測一次小鼠體質(zhì)量，空腹血糖濃度每2 周測定一次，于小鼠禁食不禁水12 h后測定。

1.3.6.2 口服葡萄糖耐量

實驗結(jié)束時（第14周）將小鼠隔夜禁食，隨后灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg mb），分別于0、30、60、90、120 min后檢測小鼠血糖含量[24]。

1.3.6.3 糖尿病相關(guān)生化指標(biāo)的測定

使用ELISA試劑盒檢測血清糖化血紅蛋白、胰島素、內(nèi)毒素和肝勻漿中肝糖原的含量，操作按說明書進行。

1.3.6.4 血脂水平檢測

使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，操作按說明書進行。

1.3.6.5 血清炎癥因子

使用ELISA試劑盒檢測血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量，操作按說明書進行。

1.3.6.6 肝臟勻漿液氧化指標(biāo)

1.3.6.7 胰腺病理切片的觀察

胰腺組織經(jīng)甲醛固定后，修塊水洗，梯度乙醇溶液脫水至透明，浸蠟包埋，經(jīng)組織切片機處理后得到厚度約為5 μm的切片，通過蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6.8 附睪脂肪組織中IL-10、Adipoq mRNA表達

以凍存的附睪脂肪組織為材料，檢測小鼠抗炎因子IL-10及脂聯(lián)素基因Adipoq mRNA的表達。具體步驟如下[25]：采用Trizol提取組織總RNA（按Trizol說明書操作），獲得的總RNA經(jīng)過濃度測定和完整性驗證，再根據(jù)PrimeScript? RT reagent試劑盒進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR），以β-actin基因作內(nèi)參。反應(yīng)體系采用20 μL體系：1 μL cDNA模板，10 μL SYBR?Premix，正、反引物各0.5 μL，加滅菌雙蒸水至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、5 s變性，60 ℃、40 s退火延伸，循環(huán)40 次?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-△△Ct方法計算[26]。引物設(shè)計見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table2 Primer sequences used in RT-qPCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均以fs表示，采用SPSS 17.0軟件包對結(jié)果進行分析，采用Origin 8.0、Excel軟件進行繪圖分析，不同組間結(jié)果比較用單因素方差的最小顯著性差異分析，統(tǒng)計結(jié)果P＜0.05認為差異顯著，病理學(xué)資料采用對比描述分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

表3 6 株乳酸菌的BSH活力Table3 BSH activity in six Lactobacillus strains

如表3所示，通過BSH活力分析可以看出，在6 株菌中D36號菌降膽固醇能力顯著高于其他菌株，其次是SY13菌。

乳酸菌在經(jīng)過胃液、膽汁環(huán)境時，大部分會因為胃液的低pH值、消化酶及膽汁鹽等因素被殺死，因此，在灌胃前篩選存活率較高的菌株以適應(yīng)胃腸道環(huán)境很有必要。從表4可以看出，在pH 4.0時，D36、D18、SY13菌均有較高的存活率，隨著pH值的降低菌株存活率明顯下降，當(dāng)pH值降低到2.0時，還保持一定耐酸優(yōu)勢的3 株菌分別是D6、D36和SY13菌；因此，綜合3 個pH值梯度可以看出D36和SY13菌耐酸性較好。

表4 6 株乳酸菌的耐酸性Table4 Acid tolerance of six Lactobacillus strains

如表5所示，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%膽鹽條件下，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h后，除D6之外，其他5 株菌存活率都在30%以上，有較強的膽鹽耐受能力。有研究表明，在高膽鹽刺激下，產(chǎn)胞外多糖的增加以及外膜強度的增加可能是乳酸菌耐膽鹽機理[27]。

實驗室新進檢驗員一般具有大專以上的學(xué)歷，優(yōu)秀者具有碩士以上學(xué)歷，都經(jīng)過全日制大學(xué)的規(guī)范教育；專業(yè)理論基礎(chǔ)比較扎實，年紀(jì)輕，對工作有較強的好奇心和上進心，對工作和職業(yè)生涯有著美好的憧憬；藥學(xué)專業(yè)或相關(guān)專業(yè)出身，接收過良好的正規(guī)教育，行為舉止比較規(guī)范；以上均是其可塑性比較強的優(yōu)點。同時也存在一些需要調(diào)整和訓(xùn)練的方面：比如專業(yè)理論扎實，但實際試驗操作和動手能力較弱，所以科室主任應(yīng)針對試驗操作能力挑選有豐富實戰(zhàn)經(jīng)驗的帶教老師對其進行相應(yīng)的培養(yǎng)和培訓(xùn)。

表5 6 株乳酸菌的耐膽鹽能力Table5 Bile salt tolerance of six Lactobacillus strains

綜合BSH活力、耐酸性、膽鹽耐受性，篩選出D36菌和SY13菌作為灌胃小鼠菌株。

2.2 對高糖高脂小鼠體質(zhì)量的影響

圖1 兩株乳酸菌對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of two Lactobacillus strains on body mass in diabetic mice

如圖1所示，各組小鼠因是隨機分組，初始體質(zhì)量基本一致。經(jīng)過14 周的喂養(yǎng)，小鼠體質(zhì)量均有增加，但增長幅度不同。N組小鼠體質(zhì)量增長幅度最大，增長率最高，M組增長幅度較N組明顯降低，可能是因為長時間高糖高脂飼料的飼喂使小鼠出現(xiàn)一些病變，攝食量減少，而灌胃SY13菌與36號菌顯著改善了小鼠的健康狀況，體質(zhì)量增長率較高，與N組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 對高糖高脂小鼠空腹血糖濃度的影響

表6 兩株乳酸菌對糖尿病小鼠空腹血糖濃度的影響Table6 Effects of two Lactobacillus strains on fasting blood glucose in diabetic mice

如表6所示，高糖高脂飲食使小鼠空腹血糖濃度一直在升高，到第14周時，M組小鼠空腹血糖濃度（12.75 mmol/L）顯著高于N組（2.62 mmol/L）（P＜0.05）。經(jīng)過菌液的灌胃，小鼠空腹血糖濃度呈下降趨勢，從第10周開始時得到明顯抑制，到第14周時SY13菌組空腹血糖濃度下降到9.75 mmol/L，D36菌組下降到6.36 mmol/L，與M組相比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明乳酸菌能明顯降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖濃度，對高血糖癥有一定療效。

2.4 對高糖高脂小鼠口服葡萄糖耐量的影響

由表7可知，M組小鼠空腹血糖濃度為12.17 mmol/L，顯著高于N組小鼠空腹血糖濃度（7.95 mmol/L），顯示高糖高脂飲食加速誘導(dǎo)動物患糖尿病的模型造模獲得成功。各組小鼠在給予葡萄糖（2 g/kg mb）30 min后，血糖濃度均急劇升高并達到頂峰，然后隨著時間延長血糖濃度下降，但M組仍處在較高的水平上。120 min后，N組血糖濃度基本回到灌胃前的水平，說明N組小鼠口服葡萄糖耐量正常[28]。而M組的血糖濃度（22.77 mmol/L）遠高于0 min（12.17 mmol/L），說明M組小鼠已基本喪失了調(diào)節(jié)血糖的能力，而SY13菌組與D36菌組120 min后的血糖濃度只略高于0 min時，與M組相比有顯著差異（P＜0.05），說明灌胃菌液可以有效減緩小鼠餐后血糖濃度升高，并改善其調(diào)控血糖的能力。

表7 兩株乳酸菌對糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影響Table7 Effects of two Lactobacillus strains on oral glucose tolerance in diabetic mice

2.5 兩株乳酸菌對高糖高脂小鼠糖尿病相關(guān)指標(biāo)的影響

表8 兩株乳酸菌對小鼠糖尿病相關(guān)指標(biāo)的影響Table8 Effects of two Lactobacillus strains on biochemical indexes in diabetic mice

糖化血紅蛋白是紅細胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，可以表征一段時間內(nèi)的血糖控制水平，與胰島素共同是衡量糖尿病的金指標(biāo)。血糖濃度越高，糖化血紅蛋白含量含量就越高[29]。由表8可知，M組糖化血紅蛋白相對含量（26.34f3.72）顯著高于N組（13.56f3.48）（P＜0.05），在這種高血糖狀態(tài)時，M組內(nèi)毒素含量的升高（M組顯著高于N組）使糖代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，使胰島素含量異常升高（M組顯著高于N組），加速了機體對儲存糖原的消耗，使肝糖原含量顯著下降（M組顯著低于N組），從而進一步加重糖代謝的紊亂。但是相對M組，通過一段時間菌液的灌胃，SY13組糖化血紅蛋白含量顯著下降（P＜0.05），D36組含量下降不顯著（P＞0.05），但肝糖原含量卻明顯增加（1.96 mg/g），高于M組（0.83 mg/g），說明兩株菌液的灌胃在糖尿病相關(guān)生化指標(biāo)上有一定改善作用，均在一定程度上降低了小鼠的血糖水平，緩解了小鼠糖代謝紊亂狀況。

2.6 對高糖高脂小鼠血脂水平的影響

從圖2可以看出，第6、10周和第14周時M組的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均高于N組，第10周時兩組間差異最為顯著（P＜0.05），TG水平除外，說明長期高糖高脂飲食導(dǎo)致了小鼠脂質(zhì)代謝的紊亂，到第10周時極為嚴(yán)重。而灌胃SY13菌組與D36菌組，TC、LDL-C指標(biāo)相較M組明顯降低，在第14周時降低最顯著（P＜0.05），HDL-C水平則在第14周時高于M組但差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，兩株乳酸菌對2型糖尿病小鼠的血脂水平均有明顯改善，且D36菌改善效果優(yōu)于SY13菌。

圖2 兩株乳酸菌對糖尿病小鼠血脂各項指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of two Lactobacillus strains on blood lipids in diabetic mice

2.7 對血清炎癥因子的影響

圖3 兩株乳酸菌對糖尿病小鼠血清炎癥因子的影響Fig.3 Effects of two Lactobacillus strains on serum inf l ammatory factors in diabetic mice

從圖3可知，第6、10周和第14周M組小鼠血清促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度總體高于N組，且第6周時二者差異顯著（P＜0.05），IL-1β除外，其在第14周時差異顯著（P＜0.05）。M組抗炎因子IL-10質(zhì)量濃度則在3 個時間點均低于N組。與M組相比較，灌胃SY13菌組與D36菌組的小鼠血清促炎因子TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度在第6周時有所下降，第10周時質(zhì)量濃度異常升高，但到第14周時可以看出比第10周又有所下降，而抗炎因子IL-10的含量則從第6、10周到第14周3 個時間節(jié)點呈現(xiàn)一個逐漸上升的趨勢，并且在第14周時兩個菌液灌胃組IL-10質(zhì)量濃度均顯著高于M組（P＜0.05），說明灌胃菌液促進了機體對高脂血癥引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)做出積極的抗炎反應(yīng)。

2.8 對高糖高脂小鼠肝臟勻漿抗氧化活性的影響

圖4 兩株乳酸菌對糖尿病小鼠肝勻漿液抗氧化活性的影響Fig.4 Effects of two Lactobacillus strains on antioxidant defense status in liver homogenate of diabetic mice

從圖4可以看出，相對N組，攝食高糖高脂飼料后，M組小鼠肝臟MDA水平顯著上升，在第14周時二者差異顯著（P＜0.05），GSH-Px和SOD活力則下降，在第10周時的差異最顯著（P＜0.05）。第16周SY13菌組和D36菌組的CAT活力（第6、10周數(shù)據(jù)未顯示）有所下降，但與N組差異不顯著，表明長期高脂飼料的攝入加重了肝臟的負擔(dān)，使肝臟組織發(fā)生了嚴(yán)重的氧化損傷。而菌液灌胃使小鼠肝臟的抗氧化活性均有不同程度提高，其中GSH-Px活力提高最為明顯，且SY13菌優(yōu)于D36菌，其在3 個時間節(jié)點上GSH-Px活力均高于M組；而SOD活力則從第6周時低于M組逐漸提高到14周時高于M組，但與M組之間差異不顯著；SY13菌組與D36菌組CAT活力在第14周時顯著高于M組（P＜0.05）。與M組相比，兩個菌液灌胃組小鼠MDA水平均有不同程度降低，且在第14周時MDA水平降低最顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，灌胃乳酸菌可以減輕2型糖尿病小鼠的肝臟過氧化，提高機體的抗氧化活性。

2.9 小鼠胰腺組織病理學(xué)的變化

圖5的HE結(jié)果顯示，第6周時M組小鼠部分胰島細胞變性，變性的胰島細胞胞漿腫脹，胞漿內(nèi)可見泡狀結(jié)構(gòu)。SY13菌組小鼠病變較輕，D36菌組局部胰島細胞變性，變性細胞胞漿腫脹，紅染顆粒狀物質(zhì)團塊明顯可見。

圖5 HE染色分析各組小鼠胰腺病理變化（200×)Fig.5 Pathological changes of pancreatic tissues in mice from different groups evaluated by HE staining (200 ×)

第10周時M組小鼠病變加重，胞核偏位，變性的胰島細胞增多，胞漿內(nèi)泡狀結(jié)構(gòu)增加，SY13菌組小鼠出現(xiàn)病變，胞漿內(nèi)可見泡狀結(jié)構(gòu)，D36菌組小鼠腺泡細胞空泡變性，紅染顆粒狀物質(zhì)團塊現(xiàn)象加重。

到第14周時M組小鼠胰島萎縮，數(shù)量減少，面積縮小，胰島細胞排列紊亂，局灶性腺泡細胞空泡變性，胞漿內(nèi)可見嗜酸性顆粒狀物質(zhì)的泡狀結(jié)構(gòu)。與M組相比，SY13菌組局灶性腺泡細胞空泡病變減輕，變性胰島細胞數(shù)量減少，而D36菌組胰島細胞排列整齊，細胞胞漿豐富均勻，腺泡細胞空泡變性消失，病變程度明顯得到改善。

上述結(jié)果表明，長期高糖高脂飲食嚴(yán)重損壞了小鼠胰腺組織，兩種乳酸菌的灌胃能明顯改善小鼠胰島細胞病變情況，極大減輕腺泡細胞空泡變性程度。

2.10 兩株乳酸菌對高糖高脂小鼠脂肪組織IL-10、Adipoq基因表達的影響

IL-10是一種積極的抗炎細胞因子。Adipoq是一種在脂肪組織中產(chǎn)生和分泌的脂肪細胞因子，通過抑制炎癥反應(yīng)來影響外周組織中脂肪酸的代謝，與肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病等疾病密切相關(guān)，這些疾病患者很多脂肪細胞因子的血漿濃度明顯上升，但脂聯(lián)素水平卻顯著下降[30]。

圖6 兩株乳酸菌對糖尿病小鼠IL-10、Adipoq mRNA表達的影響Fig.6 Effects of two Lactobacillus strains on mRNA expression of IL-10 and Adipoq in diabetic mice

實驗檢測了各處理組小鼠附睪脂肪組織中二者的表達情況，結(jié)果如圖6所示。高糖高脂飲食處理使IL-10和Adipoq的表達有所降低，但與N組差異不顯著。與M組相比，灌胃D36菌與SY13菌液顯著提高了IL-10基因的表達水平（P＜0.05），這一結(jié)果與前述的炎癥因子的影響一致，Adipoq基因表達變化則不顯著。結(jié)果表明，菌液可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與炎癥因子相關(guān)基因的表達，進而改善機體脂代謝紊亂。

3 討 論

許多研究表明高脂飼料喂養(yǎng)和STZ注射是形成2型糖尿病模型的2 個重要條件[31-32]，本研究在前人對大鼠造模的基礎(chǔ)上，采用高糖高脂飼料飼喂Balb/c小鼠誘導(dǎo)胰島素抵抗，然后分次注射亞致病劑量STZ破壞胰腺功能，使胰島β細胞對糖反應(yīng)性下降，最后誘發(fā)出高血糖癥及脂代謝紊亂等一系列糖尿病表現(xiàn)。通過一段時間乳酸菌的灌胃，測定各組小鼠血脂水平、血清炎性因子水平、肝臟抗氧化活性、糖尿病相關(guān)指標(biāo)、胰腺病理切片及附睪脂肪組織基因表達情況，評估了兩株乳酸菌對改善糖尿病小鼠糖脂代謝的作用。

實驗結(jié)果表明，長期高糖高脂飼料的喂養(yǎng)使小鼠出現(xiàn)了血糖濃度上升、胰島素水平增加及血脂水平上升等現(xiàn)象，表明小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的胰島素抵抗[33]。口服葡萄糖耐量結(jié)果顯示，小鼠空腹注射葡萄糖120 min后，N組血糖濃度基本回到灌胃前的水平，但M組外周血糖仍不能降至正常水平，說明小鼠糖耐量受損，胰腺組織HE染色結(jié)果進一步說明小鼠胰島細胞受損。經(jīng)過14周菌液的灌胃，小鼠糖化血紅蛋白含量、胰島素水平及血脂TG、TC、LDL-C水平均顯著下降，說明乳酸菌具有降糖降脂的功效。炎性因子和肝臟抗氧化活性結(jié)果表明，隨著菌液灌胃時間的延長，血清中致炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量逐漸下降，抗炎因子IL-10含量顯著上升高于M組（P＜0.05），肝臟MDA水平明顯降低，GSH-Px和SOD水平顯著上升，說明乳酸菌能夠提高機體對高脂飲食誘發(fā)的脂代謝紊亂做出積極的抗炎反應(yīng)和氧化應(yīng)激能力。

Adipoq是脂肪細胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)，可以促進骨骼肌細胞的脂肪酸氧化和糖吸收，明顯加強胰島素的抑制糖原異生作用，抑制肝臟的糖生成，是機體脂質(zhì)代謝和血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子。另外Adipoq是一種胰島素增敏激素，能改善小鼠的胰島素抗性，抑制TNF的生成與釋放，具有一定的抗炎癥作用。本研究表明，與M組相比，乳酸菌的灌胃能刺激糖尿病小鼠Adipoq mRNA使其表達量增加，顯著降低TC和LDL-C水平，這與實驗性動脈粥樣硬化模型中，血漿Adipoq水平與TC和LDL-C呈負相關(guān)關(guān)系，與HDL-C呈正相關(guān)關(guān)系結(jié)論一致。