張登科，張慧恩，朱艷杰，楊巨鵬，雷葉斯，楊 華,*，婁永江*

（1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800；2.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

大黃魚（Pseudosciaena crocea Richardson）屬于硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬，又名“黃花魚”、“長命魚”等[1]，是我國東海四大經(jīng)濟魚類之一，其肉質(zhì)細膩鮮美，富含蛋白質(zhì)、維生素及二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等高不飽和脂肪酸，深受國內(nèi)外消費者的喜愛[2]。上世紀80年代以來，由于過渡捕撈等原因，東海野生大黃魚已難以形成漁汛，隨著大黃魚人工育苗技術(shù)的突破，大黃魚現(xiàn)主要依靠人工養(yǎng)殖方式進行生產(chǎn)，我國是養(yǎng)殖大黃魚重要的出口國，養(yǎng)殖大黃魚具有較大的出口規(guī)模[3]。目前，我國養(yǎng)殖大黃魚以鮮活銷售為主，雖然其產(chǎn)量不斷增加，經(jīng)濟效益卻未見大幅提升[4]。究其原因，主要是大黃魚不易保存[5]，現(xiàn)階段缺少良好的加工貯藏方式，大黃魚加工產(chǎn)品仍以初級加工的冷凍品、罐制品、腌制品等為主，精深加工及高附加值產(chǎn)品少[6]。因此，需要一種更好的加工保鮮處理方式來提高產(chǎn)品品質(zhì)，提升養(yǎng)殖大黃魚產(chǎn)品附加值，這對全國養(yǎng)殖大黃魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展及升級具有重大意義。

超高壓技術(shù)（high hydrostatic pressure，HHP）是一種新興食品加工技術(shù)，通過一定的液體介質(zhì)（一般情況下為水），在一定的溫度下對樣品進行100～1 000 MPa處理[7]。HHP屬于純物理冷加工技術(shù)，利用高擠壓、高滲透及卸壓時的膨脹作用殺滅食品中的微生物，鈍化酶或使其部分失活，使蛋白質(zhì)變性，從而避免熱加工的破壞作用，達到延長食品的貯藏期、保持食品原有的營養(yǎng)成分與風味[8-9]的效果，現(xiàn)階段HHP已在諸多食品領(lǐng)域有所運用[10]。HHP可以破壞維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的各種化學(xué)鍵，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)改變，甚至使蛋白發(fā)生變性。而HHP對養(yǎng)殖大黃魚魚肉肌原纖維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響鮮有報道。

蛋白質(zhì)構(gòu)象復(fù)雜，檢測方法較多且各有側(cè)重：熒光分光光度法應(yīng)用于分析其內(nèi)源熒光性；傅里葉變換紅外光譜法應(yīng)用于測定蛋白官能團結(jié)構(gòu)；圓二色光譜（circular dichroism，CD）法應(yīng)用于測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；激光拉曼光譜法可快速、無損檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，定性、定量分析蛋白質(zhì)功能基團的變化；掃描電子顯微鏡法用于觀察蛋白微觀結(jié)構(gòu)。本研究以養(yǎng)殖大黃魚魚肉為原料，經(jīng)過不同壓力和保壓時間下的HHP處理，通過熒光分光光度測定、傅里葉變換紅外光譜分析、CD分析、激光拉曼光譜分析、掃描電子顯微鏡觀察，研究HHP處理對養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及產(chǎn)品品質(zhì)的影響，為HHP處理海水魚類生產(chǎn)加工提供理論支撐，進一步拓寬水產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖大黃魚購于寧波路林市場，體質(zhì)量為（0.5f0.1）kg，冰盒運回實驗室，清水沖洗，去頭、尾、皮、骨，取肉。魚肉置于絞肉機中絞碎至肉糜，分裝于10 cmh10 cm真空包裝袋中，每袋約22 g，真空包裝。Beyotime二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.M1 HHP處理設(shè)備（0～600 MPa） 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；PL2002電子分析天平、FE20-pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZ-400雙室真空包裝機 寧波江東明興包裝設(shè)備物資有限公司；J-26XP高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；ALPHA2-4冷凍干燥儀 上海實維實驗儀器技術(shù)有限公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機 上海維誠儀器有限公司；F4600熒光分光光度儀、E-1010鍍金儀、S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；inVia-reflex激光拉曼光譜儀 英國Renishaw公司；J-1500 CD儀 日本JASCO分光株式會社。

1.3 方法

1.3.1 HHP處理條件

將真空包裝的魚肉置于0 ℃冰溫環(huán)境下，分兩組進行HHP處理：第1組HHP條件為：壓力150、200、250、300、350、400、450、500 MPa，保壓時間10 min；第2組HHP條件為：壓力300 MPa，保壓時間5、10、15、20、25、30 min。水相保壓，升壓速率15 MPa/s，泄壓過程在3 s內(nèi)完成，內(nèi)腔溫度約4 ℃，以未處理組樣品為空白對照組，置于－40 ℃冰箱備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參照Jiang Xinjing[11]和Chin[12]等的方法稍作修改。取適量魚肉，加4 倍體積4 ℃提取液（20 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液），7 500 r/min勻漿60 s，4 ℃下7 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)勻漿、離心2 次。勻漿60 s，加4 倍體積冰洗液（0.1 mol/L NaCl溶液），7 000 r/min冷凍離心10 min，棄上清液，重復(fù)勻漿、離心1 次。勻漿60 s，加4 倍體積冰洗液，3 層紗布過濾，7 000 r/min 4 ℃冷凍離心10 min，肌原纖維蛋白沉淀稱質(zhì)量后置于塑料培養(yǎng)皿中，包保鮮膜，－40 ℃冷凍48 h，于ALPHA2-4冷凍干燥儀中冷凍干燥24 h，將肌原纖維蛋白用液氮研磨成粉，真空包裝，干燥保存。

1.3.3 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的測定

稱取0.100 g肌原纖維蛋白樣品，溶于10 mL質(zhì)量分數(shù)3.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，漩渦混勻5 s，37 ℃水浴30 min。采用Beyotime BCA蛋白濃度試劑盒測定濃度，稀釋液為質(zhì)量分數(shù)3.5% SDS，將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96 孔板的標準品孔中，加稀釋液補足20 μL，即標準品終質(zhì)量濃度分別為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL；加10 μL樣品到96 孔板的樣品孔中，加10 μL稀釋液補足20 μL并記錄樣品體積，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃恒溫搖床放置30 min，用酶標儀在593 nm波長處測定OD值，根據(jù)標準曲線和樣品體積計算出樣品蛋白的質(zhì)量濃度。

1.3.4 肌原纖維蛋白熒光強度測定

參考Xu Yangshun等[13]的方法，精確稱取肌原纖維蛋白0.100 g，溶于5 mL質(zhì)量分數(shù)3.5% SDS溶液中，37 ℃水浴2 h，濾紙過濾。設(shè)置激發(fā)波長為276 nm，發(fā)射波長范圍280～450 nm，掃描速率12 000 nm/min，以質(zhì)量分數(shù)3.5% SDS作空白。

1.3.5 肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜測定

取適量樣品與100 mg KBr（質(zhì)量比1∶100）混合，研磨、壓片。使用Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀于4 000～400 cm－1進行檢測，室溫25 ℃掃描并記錄光譜[14]。

1.3.6 肌原纖維蛋白CD測定

根據(jù)Masahiro等[15]的方法，配制0.02～0.20 mg/mL的樣品蛋白溶液，以蒸餾水為空白，于190～250 nm范圍內(nèi)進行掃描，選用1 mm比色皿，室溫25 ℃，掃描速率為100 nm/min，0.25 s響應(yīng)，消除本底，每組樣品重復(fù)掃描3 次。α-螺旋含量計算公式如下。

式中：θ208為樣品中殘基橢圓度/（deggcm2/dmol）。

1.3.7 肌原纖維蛋白激光拉曼光譜測定

取適量肌原纖維蛋白，采用inVia-reLex激光拉曼光譜儀測定，激發(fā)波長785 nm，掃描范圍400～3 200 cm－1，激發(fā)功率140 mW，曝光10 s/次，掃描3 次取平均值。

1.3.8 肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡觀察

將樣品制成2 mmh2 mmh1 mm的薄片，放入質(zhì)量分數(shù)3%戊二酸溶液在4 ℃下固定24 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，15 min/次；用質(zhì)量分數(shù)1%鋨酸溶液固定樣品1 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，15 min/次。依次用體積分數(shù)30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液對樣品進行脫水處理15 min[16]，再用無水乙醇處理2 次，每次10 min。依次用無水乙醇-叔丁醇混合液（體積比分別為3∶1、1∶1、1∶3）處理10 min，再用叔丁醇處理樣品10 min。加適量叔丁醇，放入－70 ℃冰箱2 h，然后放入冷凍干燥機干燥48 h，取適量樣品粘貼在樣品銅臺，采用E-1010鍍金儀鍍金，真空度1.32h10－5～1.32h10－6Pa，電壓1.1～1.2 kV，鍍膜2～3 min，掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Off i ce Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HHP處理后肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光分析

圖1 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min內(nèi)源熒光強度變化Fig.1 Endogenous fl uorescence spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖2 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強度變化Fig.2 Endogenous fl uorescence spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

如圖1、2所示，肌原纖維蛋白的最大吸收波長（λmax）分布在320 nm左右，λmax在保壓時間10 min、壓力200 MPa時開始出現(xiàn)不同程度的紅移（λmax向長波長方向移動），隨著壓力的增大以及保壓時間的延長，紅移并沒有繼續(xù)，但熒光強度增強。λmax與色氨酸殘基所在的環(huán)境有很大的關(guān)系，當色氨酸殘基在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境時，λmax小于330 nm；當色氨酸殘基在蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境時，λmax大于330 nm。本研究中λmax在320 nm附近，表明色氨酸殘基大多在蛋白質(zhì)內(nèi)部的非極性環(huán)境中；λmax出現(xiàn)紅移說明經(jīng)過HHP處理，養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白色氨酸殘基移動到蛋白質(zhì)的外部，使色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中，而熒光強度的改變則說明HHP處理使更多的色氨酸殘基暴露到蛋白質(zhì)分子表面更強的極性環(huán)境中。HHP處理改變了肌原纖維蛋白中色氨酸殘基的微環(huán)境[17]。

2.2 HHP處理后肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min傅里葉變換紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖4 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

如圖3、4所示，樣品在紅外區(qū)出現(xiàn)若干個特征吸收峰，養(yǎng)殖大黃魚魚肉的肌原纖維蛋白在酰胺A帶（3 300 cm－1左右）、酰胺B帶（3 100 cm－1左右）、酰胺I帶（1 660 cm－1左右）、酰胺II帶（1 570、1 300 cm－1左右）都有吸收峰出現(xiàn)[18]。隨著壓力的增大，酰胺A帶峰值減弱，且隨著保壓時間的延長發(fā)生偏移，說明壓力的增大和保壓時間的延長使肌原纖維蛋白中的氫鍵發(fā)生變化。隨著壓力增加，1 742 cm－1處吸收峰消失，1 650 cm－1處吸收峰減弱，這都說明碳氧雙鍵（—C＝O）的結(jié)構(gòu)或所處的化學(xué)環(huán)境發(fā)生了改變，可能是因為碳原子周圍電負性強的原子增加，使—C＝O上面的電子云密度減小，導(dǎo)致吸收峰減弱。在HHP處理過程中，可能是因為水分子在其作用下進入蛋白分子中，使大分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了一系列的變化，使肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)改變。

2.3 HHP處理后肌原纖維蛋白CD分析

圖5 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min CD圖譜Fig.5 CD spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖6 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白CD圖譜Fig.6 CD spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

蛋白質(zhì)CD的190～240 nm為遠紫外區(qū)，是肽鍵的吸收范圍，同時也包含了主鏈構(gòu)象信息。在222～208 nm波長范圍內(nèi)會出現(xiàn)雙槽曲線（即負肩峰）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[19]。由圖5、6可知，在208 nm和222 nm處出現(xiàn)兩個負凹槽，208 nm處為負肩峰，并且在210～220 nm波長之間存在一個很微弱的正峰。208 nm和222 nm負凹槽的負科頓效應(yīng)是由于蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)引起的，220 nm波長處負肩峰的出現(xiàn)表示樣品存在β-折疊結(jié)構(gòu)，210～220 nm波長處的微弱正峰表明該樣品無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的存在[20]。

150～500 MPa處理10 min時蛋白α-螺旋含量分別為14.66%、11.83%、10.39%、8.17%、5.40%、6.45%、4.61%、3.49%；隨著壓力的增大峰值逐漸變小，蛋白α-螺旋含量隨著壓力增加而減小。300 MPa處理5～30 min時蛋白α-螺旋含量分別為7.78%、8.17%、5.20%、5.36%、5.12%、3.48%；隨著保壓時間的延長峰值逐漸變小，蛋白α-螺旋含量也逐漸變小。150 MPa處理10 min時α-螺旋含量最大，為14.66%；隨著壓力的增大，α-螺旋含量逐漸降低。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是由多肽鏈借助氫鍵沿著某個軸盤旋或折疊形成的規(guī)則性和有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，主要表現(xiàn)為α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[21]。相關(guān)研究表明，α-螺旋結(jié)構(gòu)對壓力處理比較敏感[22]，與本研究結(jié)果一致。主要原因是HHP處理影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)氫鍵的穩(wěn)定性，氫鍵又是影響蛋白二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象穩(wěn)定性的重要因素，蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)主要是靠多肽鏈上羰基（—C＝O）和氨基（—NH2）之間的氫鍵維持[23-24]。

2.4 HHP處理后肌原纖維蛋白激光拉曼光譜分析

圖7 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min激光拉曼光譜Fig.7 Laser Raman spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖8 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白激光拉曼光譜Fig.8 Laser Raman spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

如圖7、8所示，酰胺I帶集中在約1 650 cm－1處，其是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的特殊表征[27]。有研究表明，在1 600～1 700 cm－1處的酰胺I帶與蛋白骨架構(gòu)象類型相關(guān)[28]。α-螺旋結(jié)構(gòu)集中在1 650～1 660 cm－1處，β-折疊結(jié)構(gòu)集中在1 665～1 680 cm－1處，無規(guī)卷曲集中在1 660～1 665 cm－1處[29]。肌原纖維蛋白激光拉曼光譜的指認見表1。研究表明，隨著壓力的增加，蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)不斷減少，β-折疊或者無規(guī)卷曲增加，其二級結(jié)構(gòu)間的轉(zhuǎn)化表明蛋白氫鍵的重排，CD結(jié)果也證明了這一點，與Choi等[30]的研究結(jié)果相符。

表1 激光拉曼光譜條帶指認[25-26]Table1 Attribution of Raman bands[25-26]

2.5 不同壓力處理肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖9 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min掃描電子顯微鏡圖Fig.9 Scanning electron microscopic analysis of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

如圖9所示，不同壓力處理養(yǎng)殖大黃魚魚肉肌原纖維蛋白的微觀結(jié)構(gòu)存在明顯的差別。未處理組蛋白表面沒有孔洞，結(jié)構(gòu)平整、致密。經(jīng)HHP處理后蛋白表面逐漸出現(xiàn)孔洞，300 MPa處理時蛋白表面的孔洞均勻，結(jié)構(gòu)松散、均勻；350 MPa處理時蛋白表面形成較大的孔洞，凝膠組織呈絮狀，結(jié)構(gòu)松散、均勻；壓力為400 MPa時結(jié)構(gòu)出現(xiàn)坍塌；當壓力增大到500 MPa時，蛋白結(jié)構(gòu)呈纖維狀。這可能是由于HHP誘導(dǎo)蛋白發(fā)生均勻變性，蛋白聚合形成空間立體的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成的[31]。蛋白微觀結(jié)構(gòu)的變化可能是由于一定的壓力條件改變了蛋白分子內(nèi)和分子間作用力，破壞了蛋白結(jié)構(gòu)[32]。這與傅里葉變換紅外光譜、CD、拉曼光譜的分析結(jié)果一致，蛋白表面形成的孔洞使水分子與蛋白的接觸面積大幅增加，引起大量氨基酸殘基的化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變，增大了蛋白分子內(nèi)部疏水性位點的暴露程度，影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)氫鍵的穩(wěn)定性，維持蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的羰基（—C＝O）和氨基（—NH2）之間的氫鍵被破壞，羰基與水分子形成新的氫鍵，因此壓力對肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)影響較大[33]。

圖10 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig.10 Scanning electron microscopic images of myof i brillar protein treated for different durations at 300 MPa

如圖10所示，蛋白表面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)隨著保壓時間的改變而改變。隨著保壓時間的延長，蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加明顯。當保壓10 min時，蛋白孔隙均勻，組織呈絮凝狀，結(jié)構(gòu)松散、均勻；保壓20 min時，蛋白表面孔洞較大，組織呈絮凝狀，結(jié)構(gòu)松散、不均勻；之后隨著保壓時間的延長蛋白表面不再有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但300 MPa處理30 min蛋白呈較為緊湊的纖維結(jié)構(gòu)。微觀結(jié)構(gòu)的改變使蛋白質(zhì)的表面疏水性變大，溶解性降低，這與表面疏水性的研究結(jié)果一致。蛋白微觀結(jié)構(gòu)的變化與其保壓時間密切相關(guān)，壓力改變了蛋白分子內(nèi)和分子間作用力，破壞了蛋白結(jié)構(gòu)，這與付強[34]的研究結(jié)果相似。HHP處理促進養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白的變性，壓力越大、保壓時間越長其變性程度越大，變性程度直接影響著肌原纖維蛋白的微觀結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白經(jīng)HHP處理，蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變。HHP處理使蛋白中色氨酸殘基移動并暴露在其外部的極性環(huán)境；使水分子進入蛋白分子內(nèi)部，使大分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化，其中α-螺旋含量隨壓力的升高和保壓時間的延長而逐漸降低。蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的變化是導(dǎo)致養(yǎng)殖大黃魚魚肉表觀特性改變的重要原因，有研究表明，經(jīng)HHP處理的蛋白質(zhì)在持水性[35]、溶解性[36]、乳化性[37]、表面疏水性[38]、熱穩(wěn)定性[39]、巰基含量[40]等方面都有顯著變化，這可能都與蛋白結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。