高坤平 楊文信

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院皮膚科，四川 瀘州 646000）

脂溢性皮炎又稱(chēng)為脂溢性濕疹，是發(fā)生在皮脂腺豐富部位如頭皮、前胸、腋窩，的一種炎癥性皮膚病。以紅斑、丘疹、鱗屑為主要皮損表現(xiàn)，同時(shí)伴有不同程度的瘙癢，中醫(yī)稱(chēng)為“油面風(fēng)”“白屑風(fēng)”等。病程日久，反復(fù)發(fā)作，形成惡性循環(huán)，甚至擴(kuò)展至全身，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。馬拉色菌（malassezia）是皮膚表面的常駐菌，與脂溢性皮炎的發(fā)病密切相關(guān)，是導(dǎo)致頭皮脂溢性皮炎的重要原因［2］。治療脂溢性皮炎的主流是抗真菌治療，西藥治療復(fù)發(fā)率高，不良反應(yīng)大。因此，尋找作用安全、療效滿(mǎn)意的抗馬拉色菌藥物的任務(wù)巨大。中醫(yī)以整體觀念與辨病辨證為理論基礎(chǔ)，物美價(jià)廉，高效低毒，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。復(fù)方皂礬功能洗發(fā)香波為純中藥制成，使用舒適，安全性好。目前治療脂溢性皮炎的中藥或復(fù)方中藥外洗劑缺乏深入系統(tǒng)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究，多以個(gè)案或個(gè)別單位小樣本量臨床研究為主［3］。為深入研究其作用機(jī)制所以我們對(duì)復(fù)方皂礬功能洗發(fā)香波進(jìn)行了體外抗馬拉色菌藥敏實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株 （1）臨床馬拉色菌株：由我院微生物室分離鑒定獲得。（2）標(biāo)準(zhǔn)菌株：廣東微生物研究所微生物保藏中心提供糠秕馬拉色菌 GIMCC編號(hào)：GIM2.181=ATCC44344。

1.2 中藥 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑科用1000 mL 60%的乙醇浸潤(rùn)方劑（白礬2 g，苦參10 g，皂角5 g，側(cè)柏葉10 g，地膚子5 g，苦柏10 g等取5付藥材，除白礬外粉碎成粗粉末），裝柱，最終藥液含藥量2.0 g/mL，高壓滅菌冷凍存儲(chǔ)。采樂(lè)洗劑（西安楊森制藥公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20000588）：2%酮康唑洗劑。

1.3 真菌培養(yǎng)基的主要試劑 固體培養(yǎng)基：成分：氯霉素50 mg、橄欖油2.7 g、吐溫600.5 mL、酵母浸膏1 g等液體培養(yǎng)基：成分：麥芽糖20 g，橄欖油40 g，吐溫600.5 mL、酵母浸膏20 g等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 瓊脂平板擴(kuò)散法 打孔法［4］

2.1.1 固體培養(yǎng)基的制備 融化的固體培養(yǎng)基，工作臺(tái)上將其倒入每個(gè)平皿中（約12 mL）。

2.1.2 菌液配制 在固體培養(yǎng)基上接種受試菌株，每72 h傳代培養(yǎng)1次，放入35℃恒溫孵箱孵育，傳代培養(yǎng)2次后，制成菌懸液，菌含量大概為（1.0～2.0）×106CFU/mL。

2.1.3 抑菌活性的測(cè)定 將菌液2 mL均勻的涂布在培養(yǎng)基平板上，無(wú)菌打孔器在馬平板上打直徑為10 mm的孔，孔內(nèi)加入稀釋成不同濃度的藥液，恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，再用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

2.1.4 結(jié)果判讀 用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，再分別計(jì)算出每個(gè)濃度的抑菌圈直徑的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

2.2 微量液基稀釋法 參照NCCLS-M27A方案，以此為基礎(chǔ)改良后采用含4%橄欖油作為作為藥敏試驗(yàn)的液基［5］。

2.2.1 藥液加樣 在無(wú)菌操作臺(tái)上將濃度為2 g/mL的中藥貯備液用滅菌蒸餾水在無(wú)菌試管內(nèi)稀釋成試驗(yàn)濃度（見(jiàn)表3），再依次微量稀釋板每孔中加入100 μL藥液。在無(wú)菌試管內(nèi)采樂(lè)洗劑也用滅菌蒸餾水稀釋成試驗(yàn)濃度（見(jiàn)表4），再依次每孔100 μL加入微量稀釋板。再每孔中加入100 μL的液體培養(yǎng)基。同時(shí)不加菌的加入同等濃度100 μL的藥液作為陰性對(duì)照，不加藥液的加入100 μL的滅菌蒸餾水作為生長(zhǎng)對(duì)照。

2.2.2 加菌懸液 菌懸液制備同2.1.2，再向每個(gè)微孔板中依次加入100 μL菌液。

2.2.3 培養(yǎng)及結(jié)果判讀 培養(yǎng) 72 h后將1 mL培養(yǎng)液點(diǎn)種于不含藥物的無(wú)菌馬拉色菌橄欖油固體培養(yǎng)基上，72 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。固體培養(yǎng)基無(wú)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的藥物濃度確定為MIC值。

2.2.4 MIC值的判讀 生長(zhǎng)對(duì)照菌落生長(zhǎng)良好同時(shí)空白對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，判讀重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果

3.1 瓊脂平板擴(kuò)散法（打孔法） 不同濃度洗發(fā)香波藥物原液對(duì)馬拉色菌的抑菌直徑見(jiàn)表1。不同濃度采樂(lè)洗劑對(duì)馬拉色菌的抑菌直徑見(jiàn)表2。

表1 不同濃度復(fù)方皂礬功能洗發(fā)香波藥物原液對(duì)馬拉色菌的抑菌直徑

表2 不同濃度采樂(lè)洗劑對(duì)馬拉色菌的抑菌直徑

3.2 微量液基稀釋法 復(fù)方皂礬功能洗發(fā)香波藥物原液的MIC值為 0.005 g/mL （見(jiàn)表 3～4，圖 1～4）。

表3 復(fù)方皂礬功能洗發(fā)香波藥物原液對(duì)馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值

表4 采樂(lè)洗劑對(duì)馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值

圖1 瓊脂平板擴(kuò)散法（打孔法）培養(yǎng)前

圖2 瓊脂平板擴(kuò)散法（打孔法）培養(yǎng)72 h后

圖3 96微孔法培養(yǎng)72 h后

圖4 臨床分離馬拉色菌鏡下圖片

4 討論

選擇采樂(lè)作為本研究的對(duì)照藥，是因?yàn)樗鼮橹委熤缧云ぱ壮Ｓ孟磩ｋm然采樂(lè)組體外抑制馬拉色菌生長(zhǎng)比洗發(fā)香波組效果好，但洗發(fā)香波作為純中藥制劑，無(wú)任何添加，成本低廉，高效低敏，患者樂(lè)于接受，值得應(yīng)用推廣。

馬拉色菌（Malassezia）是人體及溫血?jiǎng)游锲つw表面的條件致病性嗜脂性真菌，該菌可導(dǎo)致多種皮膚病包括花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎等，致病病種多，治療也因此受到重視。脂溢性皮炎抗真菌治療為主流。因此我們要尋找安全性好、療效好且價(jià)格低廉的抗真菌藥物。從中藥尋找抗真菌藥物，前景廣闊。中藥不良反應(yīng)小，耐藥少可用于疾病的長(zhǎng)期預(yù)防治療，結(jié)合現(xiàn)代工藝，前景好。

馬拉色菌體外實(shí)驗(yàn)還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化方案。本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂平板擴(kuò)散法（打孔法）和微量稀釋法。瓊脂平板擴(kuò)散法（打孔法）雖然操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易判，但結(jié)果易受干擾，如培養(yǎng)基厚度，因此本實(shí)驗(yàn)中只定性測(cè)定抑菌效果。藥物的MIC值參照NCCLS-M27A方案，在微量孔中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易判且準(zhǔn)確。國(guó)內(nèi)外研表明采用微量法與多量法結(jié)果一致，所得的最小抑菌濃度都在2個(gè)濃度梯度內(nèi)［6］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得復(fù)方皂礬功能洗發(fā)香波藥物原液的MIC值為0.005 g/mL。洗發(fā)香波糠秕馬拉色菌抑菌作用，為深入探討洗發(fā)香波對(duì)糖秕馬拉色菌的抑菌機(jī)制、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。