張化芝，李曉雙，郭曉燁，趙明池

0 引言

乳腺癌是威脅女性生命健康的最常見惡性腫瘤類型，其發(fā)病率及死亡率均居女性惡性腫瘤首位。據最新全球腫瘤數據統計分析結果，2018年預計全球將有210萬乳腺癌新發(fā)患者，約占女性新發(fā)惡性腫瘤數的四分之一[1-2]。我國乳腺癌患者數量以每年2%~3%的增長速率遞增，同時發(fā)病年齡日趨年輕化，已成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題[3]，尋找潛在的乳腺癌治療藥物對于乳腺癌的防治具有重要的臨床意義。從臨床已使用的藥物中發(fā)現其新的適應證是一種高效的藥物篩選策略，可避免因生物利用度差、不良反應高等原因導致的成藥性困難問題。阿帕替尼（Apatinib）是一種小分子靶向的血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）酪氨酸激酶抑制劑，目前已獲批用于晚期胃腺癌或胃-食管結合部腺癌患者三線及三線以上臨床治療，可顯著延長晚期胃癌患者的生存期。經檢索得知目前有關阿帕替尼對乳腺癌細胞體內外抗腫瘤作用的研究報道十分有限。本實驗擬通過研究阿帕替尼對乳腺癌細胞凋亡的影響及其潛在的分子機制，為阿帕替尼應用于乳腺癌的臨床治療提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中科院上海細胞庫，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。常規(guī)培養(yǎng)時細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑

阿帕替尼（Apatinib, CAS: 1218779-75-9）購自大連美侖生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗溶液及胰蛋白酶購自美國Gibco公司； CCK-8試劑盒（貨號：C0037）購自碧云天生物科技有限公司（上海，中國）；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：KGA108-1）購自江蘇凱基生物科技有限公司（南京，中國）；乳酸含量檢測試劑盒（貨號：MAK064）購自Sigma公司（上海，中國）；糖酵解壓力試劑盒（貨號：103020-100）購自安捷倫科技（上海）有限公司；其余試劑為國產分析純。

1.3 CCK-8法檢測阿帕替尼對乳腺癌MDAMB-231細胞的增殖抑制作用

將對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于96孔板，接種濃度為4 000個/孔，待細胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl 的CCK-8溶液繼續(xù)于培養(yǎng)箱孵育2 h，隨后于多功能酶標儀450 nm波長處測量各孔吸光度（OD值），并計算各組細胞的細胞活力：細胞活力=OD實驗組/OD對照組×100%。每組設8個復孔，實驗重復3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響

將對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板，接種密度為3×105個/孔，待細胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化收集細胞，冷的PBS洗滌細胞2次后，重懸于100 μl的1×Annexin緩沖液中。隨后每100 μl細胞樣品加入5 μl的Annexin V及1 μl的PI，37℃水浴鍋中避光孵育30 min后，再加入400 μl的1×Annexin緩沖液稀釋，流式細胞儀檢測各樣本的細胞凋亡率。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.5 Western blot實驗檢測阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞Bcl-2及Bax表達的影響

將對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板，密度為5×105個/孔，待細胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～2.5 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后采用RIPA裂解液裂解細胞，高速離心獲得蛋白樣品。隨后采用Western blot法常規(guī)檢測不同處理組Bcl-2及Bax的表達差異，通過計算灰度值計算各組中Bcl-2及Bax蛋白的相對表達情況。

1.6 阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞乳酸產量的影響

不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液作用于MDA-MB-231細胞24 h后，消化收集對數生長期的各組MDA-MB-231活細胞1×106萬個，離心得到細胞沉淀。各組細胞樣品分別加入150 μl的乳酸實驗專用緩沖液后，對各組細胞樣品進行超聲破碎。參照試劑盒說明書對各組樣品中的乳酸含量采用比色法檢測，并根據標準曲線計算各組細胞樣品中乳酸含量的絕對值。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.7 阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞外酸化速率的影響

將對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于24孔板，接種濃度為5×104個/孔，待細胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度（0～10 μmol/L）的阿帕替尼藥液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將糖酵解壓力試劑盒中的3種藥物誘導劑分別加入加藥板上的各加藥孔中，其中葡萄糖、寡霉素及2-脫氧葡萄糖的使用濃度分別為10 mmol/L、1 μmol/L及50 mmol/L。隨后采用細胞代謝分析儀檢測各組細胞的細胞外酸化速率，并計算糖酵解能力值及糖酵解保留值。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.8 統計學方法

采用SPSS19.0對數據進行分析，數據以均數±標準差（±s）表示。組間數據差異性比較采用One-Way ANOVA法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阿帕替尼濃度依賴性地抑制乳腺癌MDAMB-231細胞的增殖

CCK-8法結果表明，阿帕替尼可濃度依賴性地抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外增殖（P=0.003），作用于MDA-MB-231細胞48 h時，阿帕替尼對MDA-MB-231細胞的半數抑制濃度IC50值約為1.56 μmol/L。此外，10 μmol/L的阿帕替尼作用于MDA-MB-231細胞48 h時，MDA-MB-231細胞存活率小于5%，見圖1。表明阿帕替尼是一種高效的乳腺癌細胞殺傷藥物。

圖1 阿帕替尼劑量依賴性地抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖Figure1 Apatinib suppressed proliferation of breast cancer cell line MDA-MB-231 in a does-dependent manner

2.2 阿帕替尼濃度依賴性地誘導乳腺癌MDAMB-231細胞凋亡

圖3 阿帕替尼劑量依賴性地誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡Figure3 Apatinib induced apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231 in a does-dependent manner

AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結果表明，阿帕替尼可濃度依賴性地誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡（P=0.001），見圖2、3。同時Western blot結果表明，阿帕替尼可增加MDA-MB-231細胞內促凋亡蛋白Bax的表達水平，下調抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，見圖4。上述結果進一步驗證了阿帕替尼體外抗乳腺癌的作用。

圖4 Western blot實驗表明阿帕替尼誘導人乳腺癌MDAMB-231細胞的凋亡Figure4 Western blot assay indicated that apatinib could induce apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231

2.3 阿帕替尼濃度依賴性地抑制乳腺癌MDAMB-231細胞內乳酸產量

比色法結果顯示，阿帕替尼可濃度依賴性地降低乳腺癌MDA-MB-231細胞內乳酸產量（P=0.004），見圖5。

圖2 流式細胞術證實阿帕替尼誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡Figure2 Flow cytometry assay indicated that apatinib could induce apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231

圖5 阿帕替尼濃度依賴性地降低乳腺癌MDA-MB-231細胞內的乳酸產量Figure5 Apatinib significantly decreased lactate production in MDA-MB-231 cells in a does-dependent manner

2.4 阿帕替尼濃度依賴性地抑制乳腺癌MDAMB-231細胞的細胞外酸化速率

為進一步證實阿帕替尼對乳腺癌MDAMB-231細胞有氧糖酵解活性的抑制作用，本研究進一步考察了阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞外酸化速率的影響，細胞代謝分析儀檢測結果顯示阿帕替尼可抑制由寡霉素激活的MDAMB-231細胞的有氧糖酵解活性（P=0.006），見圖6。進一步對各糖酵解參數進行計算，阿帕替尼可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值（P=0.003），見圖7。

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率及死亡率均居女性惡性腫瘤首位，嚴重威脅女性生命健康。據美國癌癥協會估計，美國女性一生中罹患乳腺癌的概率約為八分之一。盡管自上世紀90年代起，乳腺癌早期篩查技術的發(fā)展、輔助化療方案的應用、靶向藥物和激素療法聯合干預，以及綜合治療體系的進步，乳腺癌死亡率下降了39%，但仍僅次于肺癌居女性腫瘤病因死亡率第二位[4]。因此，開發(fā)新的乳腺癌治療藥物或治療策略對于乳腺癌的防治具有重要的臨床意義及緊迫性。

阿帕替尼是一種小分子的、靶向血管內皮細胞生長因子受體的抗血管生成藥物，已獲批用于晚期胃癌的臨床治療。此外，藥物臨床試驗結果表明阿帕替尼對于乳腺癌患者也具有較好的抗癌活性，且不良反應可控[5]，因此有必要對阿帕替尼抑制乳腺癌的作用機制進一步深入研究。本研究發(fā)現阿帕替尼可濃度依賴性地抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖，且起效濃度較低、活性較強，作用于MDA-MB-231細胞48 h時的半數抑制濃度約為1.56 μmol/L。此外，阿帕替尼可濃度依賴性地誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡，進一步驗證了阿帕替尼的抗乳腺癌活性。能量代謝是腫瘤細胞各種惡性生物學行為改變的基礎。為進一步考察阿帕替尼抗乳腺癌作用的分子機制，本研究首先證實了阿帕替尼可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞內糖代謝產物乳酸的產量。因乳酸產量增加是腫瘤細胞代謝表型有氧糖酵解效應的主要特征，本研究進一步通過實時檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞的細胞外酸化速率，證實了阿帕替尼可降低乳腺癌的糖酵解能力值及糖酵解儲備值，進而抑制MDA-MB-231細胞的有氧糖酵解活性。腫瘤細胞主要特征之一為增殖加速，該過程意味著腫瘤細胞需要更多的能量供應以滿足快速增殖的需要。因此，有異于正常細胞的主要供能方式線粒體呼吸，腫瘤細胞的能量代謝特征主要表現為糖酵解效應，即使在有氧條件下，腫瘤細胞也主要通過糖酵解的方式供能，以滿足快速增殖所需的能量及中間代謝物[6]。鑒于正常細胞及腫瘤細胞能量代謝模式的差異性，調節(jié)腫瘤細胞的糖酵解表型可作為靶向腫瘤細胞治療的潛在策略[7-8]。已有研究報道糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸體內外水平均具有抗乳腺癌活性[9-10]。本研究結果表明阿帕替尼可能是一種潛在的糖酵解抑制劑，可能通過抑制乳腺癌細胞的糖酵解過程，進而發(fā)揮抗乳腺癌增殖的作用。

圖6 阿帕替尼抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞酸化速率Figure6 Apatinib significantly decreased extracellular acidification rate (ECAR) in MDA-MB-231 cells

圖7 阿帕替尼抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值Figure7 Apatinib significantly decreased glycolytic capacity and glycolytic reserve of MDA-MB-231 cells

綜上所述，阿帕替尼可能通過抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的有氧糖酵解活性，進而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，發(fā)揮體外水平抗乳腺癌的作用，是一種有潛力的乳腺癌治療藥物。