洪艷 李莎 韓笑

【摘 要】目的：建立應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS）測定漢桃葉不同極性部位中反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸的含量。方法：樣品用甲醇-水混合溶液溶解，以乙腈-水為流動相，流速為0.25 mL/min，在柱溫30 ℃的條件下，采用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，反式二烯酸、琥珀酸、蘋果酸在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;反式二烯酸和蘋果酸的檢測限為500ng/ml， 琥珀酸的檢測限為100ng/ml。加樣回收率為91.8%～95.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～4.4%。該方法是一種靈敏度高、準(zhǔn)確度較高的測定反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸的方法，可以應(yīng)用于其他中藥材中這三種有機(jī)酸的檢測。

【關(guān)鍵詞】漢桃葉;提取;分離;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) ;有機(jī)酸;物質(zhì)基礎(chǔ)

【中圖分類號】? R249? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 B【文章編號】 1672-3783（2019）05-03-022-01

漢桃葉為五加科植物白花鵝掌柴（Scheffiera kwang siensis Merr.ex Li）的根或莖、葉，又名廣西鵝掌柴，產(chǎn)于貴州[1]。漢桃葉具有祛風(fēng)止痛，舒筋活絡(luò)之功效。用于治療三叉神經(jīng)痛，坐骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛[2]，目前被做成多種中藥制劑上市，如漢桃葉膠囊，漢桃葉片等，應(yīng)用較廣[2]。目前漢桃葉化學(xué)成分中有機(jī)酸類成分被認(rèn)是藥效作用成分[3-5]，然而有機(jī)酸類成分極性較大，含量少，因此應(yīng)用常規(guī)高效液相色譜技術(shù)同時定量幾種有機(jī)酸難度較大[6-7]。本論文利用層析技術(shù)對漢桃葉進(jìn)行分離得到不同極性部位，并采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了對漢桃葉中三種代表性的有機(jī)酸-富馬酸、琥珀酸和蘋果酸的含量測定的方法，最終應(yīng)用此技術(shù)對不同極性部位中的三種有機(jī)酸的含量進(jìn)行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT 25S型電子天平（德國賽多利斯有限公司）、Water Acquity I-class UPLC型液相色譜儀（美國沃特世公司）、Xevo TQ-S型串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國沃特世公司）;

1.2 試藥 液相用乙腈（美國西格瑪有限公司）、液相用水為娃哈哈純凈水（中國娃哈哈有限公司）。乙醇、甲醇等試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格;Hp20大孔樹脂（日本日立公司， 批號7G504）;

反丁烯二酸對照品（中國藥品生物制品檢定所， 批號：123049）;琥珀酸對照品（中國藥品生物制品檢定所， 批號：190014）;蘋果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所， 批號：110896）;本研究所使用的漢桃葉藥材由金鴻藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法

2.1 漢桃葉不同部位的富集 取漢桃葉藥材1kg，用70%乙醇提取兩次，過濾，回收醇提液，藥渣干燥，后按照藥典中水提醇沉方法再次提取藥渣，得到水提液。將醇提液與水提液合并，濃縮干燥得到浸膏粉末100g。取漢桃葉浸膏粉末65g，將其完全溶解于300ml的去離子水中，上樣至Hp20大孔吸附樹脂，依次用3倍柱體積的水、10%、20%、30%、50%、75%和95%乙醇依次洗脫， 50℃減壓濃縮至干浸膏，后凍干至干燥粉末，得到水洗脫部位（20.8g， 32%），10%乙醇洗脫部位（3.2g， 4.9%），20%乙醇洗脫部位（5.5g， 8.4%），30%乙醇洗脫部位（4.2g， 6.4%），50%乙醇洗脫部位（10.3g， 15.8%），75%乙醇洗脫部位（2.3g， 3.5%），95%乙醇洗脫部位（0.67， 1.0%）。

2.2 溶液的配置

2.2.1 樣品的制備 稱取漢桃葉各部位樣品20mg于10ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，得2mg/ml樣品溶液，過0.22 μm的微孔濾膜后直接進(jìn)樣檢測。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

分別稱取富馬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg于50ml容量瓶中，蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別得到0.2mg/ml，0.2mg/ml，1mg/ml溶液。

2.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制

分別取適量的對照品儲備液至20ml量瓶中，根據(jù)稀釋比例，用甲醇依次稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的各濃度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

2.3.1 液相色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（1.7 μm 粒徑，2.1 mm i.d × 50 mm）;流動相A和B分別為水和乙睛;流動相流速為 0.25mL·min-1。梯度洗脫條件為：0-1.2 min，5～19%B;1.2-4.2min，19～95%B; 4.2- 6.2min 95%～5%B。柱溫：30 ℃，進(jìn)樣體積：5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源：負(fù)離子模式;干燥氣（氮?dú)猓┝魉伲?2 L·min-1，離子源溫度：350 ℃，霧化器（氮?dú)猓毫Γ?5 psi，毛細(xì)管電壓：3 kV;數(shù)據(jù)采集方式多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測;各化合物檢測條件見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性范圍和檢出限 分別將2.2.3項(xiàng)下配制好的混標(biāo)溶液按照所建立的方法進(jìn)行檢測。分別以蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。如表2所示，蘋果酸在0.5～100μg/mL 濃度，反丁烯二酸在0.5～100μg/mL 濃度，琥珀酸在0.1～10μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性良好（r2>0.99）。以3 倍信噪比作為檢出限， 10 倍信噪比作為定量限。結(jié)果顯示蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的儀器檢測限分別為0.16 μg/ml 和0.16 μg/ml和0.045μg/ml; 對應(yīng)的方法定量限為0.5 μg/ml 和0.5 μg/ml和0.1μg/ml。

3.2 回收率和批內(nèi)精密度 選擇水洗脫部位為加樣回收率的樣品，分別在樣品中加入含有蘋果酸，反丁烯二酸和琥珀酸86.5，356.9，1.0μg的樣品溶液，每個濃度制備兩份樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表3。如表2所示，蘋果酸加標(biāo)樣品的平均回收率分別為94.2%、反丁烯二酸為91.8 %，琥珀酸為95.4 %， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%、4.4%和3.7%， 結(jié)果證明該方法具有較好的回收率和精密度。

3.3 漢桃葉不同洗脫部位有機(jī)酸含量的測定 對分離富集得到的漢桃葉不同提取部位中蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的含量進(jìn)行測試，結(jié)果表明蘋果酸和反丁稀二酸在水洗脫部位中的含量較高，為4.32mg/g和17.84mg/g。而琥珀酸在各部位中含量均較少，均小于0.1mg/g。

4 結(jié)論

本文首次建立了利用UPLC-MS/MS靈敏、準(zhǔn)確的測定漢桃葉不同部位中蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸含量的方法。方法在負(fù)離子模式下，應(yīng)用多反應(yīng)離子檢測，得到蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的定量限分別為0.5 μg/ml 和0.5 μg/ml和0.1μg/ml。應(yīng)用此方法，蘋果酸、反丁烯二酸和琥珀酸的回收率91.8～95.4%， 滿足方法學(xué)要求。本文應(yīng)用此方法對漢桃葉不同部位中有機(jī)酸的含量進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)水洗脫部位中有機(jī)酸含量較高，為漢桃葉藥效部位的確定提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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