劉金龍，李志敏 ，趙國群，孫錫友 ，任媛媛

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術研究中心，河北石家莊050000）

透明質酸是由葡萄糖醛酸與N- 乙酰氨基葡萄糖組成的雙糖單位重復連接而成的生物多糖，分子量顯著影響其理化性質和應用效果。高分子量透明質酸具備優(yōu)異的保濕性、粘彈性以及潤滑作用，被廣泛應用于醫(yī)藥及化妝品領域[1-2]。微生物發(fā)酵法是目前透明質酸的主要生產(chǎn)方法，但是在工業(yè)生產(chǎn)中如何實現(xiàn)高產(chǎn)量的同時保證高分子量仍是一個難題，實際上附加值較高的高分子量透明質酸產(chǎn)品，占發(fā)酵總產(chǎn)量的比例并不高[3]。為解決這一問題，國內外學者圍繞高分子量透明質酸的合成機制，從不同角度和層次展開研究。

已有報道證明微生物培養(yǎng)環(huán)境與營養(yǎng)條件顯著影響透明質酸產(chǎn)量和分子量的高低。溶氧水平對透明質酸產(chǎn)量和分子量影響顯著，較高的溶氧水平有利于高分子量透明質酸的高效合成，但發(fā)酵體系較高的攪拌轉速產(chǎn)生的剪切力會對透明質酸合成產(chǎn)生負面影響，進而影響透明質酸的產(chǎn)量和分子量；另外高溶氧衍生的氧自由基也會對透明質酸產(chǎn)量和分子量產(chǎn)生不利影響[4]。Jagannath 等研究證實培養(yǎng)溫度是影響透明質酸產(chǎn)量和分子量的另一個顯著因素，低溫環(huán)境不利于菌體生長，但卻有利于高分子量透明質酸的合成[5]。此外，Pires 研究團隊的報道證實較高濃度的碳源以及添加前體物質有利于高分子量透明質酸的合成，但較高濃度有機氮源會導致透明質酸產(chǎn)量和分子量的下降[6]。

除了培養(yǎng)環(huán)境和營養(yǎng)條件，微生物發(fā)酵生產(chǎn)胞外產(chǎn)物的效率往往受到細胞膜通透性的制約，增大細胞膜通透性可以降低胞外產(chǎn)物的分泌阻力，促進產(chǎn)物的跨膜運輸，解除產(chǎn)物反饋抑制效應，提高產(chǎn)物的合成效率[7-8]。透明質酸是典型的細菌胞外多糖，其胞內合成與向胞外分泌過程在時空上緊密關聯(lián)。透明質酸糖鏈在胞內合成的同時，向胞外分泌延伸，而其跨膜分泌延伸的過程受到細胞膜流動性和通透性的制約，因此透明質酸的產(chǎn)量和分子量與細胞膜流動性和通透性緊密相關[9]。為了提高透明質酸的產(chǎn)量和分子量，本文系統(tǒng)考查了表面活性物質Triton X-100 添加濃度、添加時機對Streptococcus equisimilis FE-11 發(fā)酵透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響，確定了最優(yōu)的添加策略，并在此基礎上比較了Triton X-100 添加與否對細胞膜結構組成的影響，印證了細胞膜流動性和通透性對透明質酸合成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

本研究采用的菌株Streptococcus equisimilis FE-11由河北省發(fā)酵工程技術研究中心保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

腦心浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，氯化鈉5 g/L，K2HPO42.5 g/L，自然pH，瓊脂20 g/L，121℃滅菌15 min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO42 g/L，調pH=7.0，121℃滅菌15 min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基（三角瓶）

葡萄糖60 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO410 g/L，調pH=7.0，121℃滅菌15 min。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（發(fā)酵罐）

葡萄糖60 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，K2HPO42 g/L，調pH=7.0，121℃滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將1～2 環(huán)斜面種子培養(yǎng)物接種至裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉速250 rpm，溫度37℃，培養(yǎng)12～14 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)（三角瓶）

將5 mL 種子培養(yǎng)液接種至裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基（三角瓶）的500 mL 三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉速250 rpm，溫度37℃，培養(yǎng)24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)（發(fā)酵罐）

5 L 發(fā)酵罐中添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積為4 L，接種量為5%（V/V），溫度37℃，通氣量4 L/min，攪拌轉速為400 rpm，發(fā)酵過程中通過流加氫氧化鈉溶液控制pH=7。

1.4 菌體濃度的測定

采用紫外可見分光光度計法，將發(fā)酵終點的發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，在波長660 nm 處測其吸光度OD 值，根據(jù)吸光度與細胞干重關系式求得菌體濃度。

1.5 脂肪酸測定

采用Folch 法提取細胞膜磷脂，提取的磷脂經(jīng)0.5 mol/L KOH-CH3OH 溶液皂化，然后在三氟化硼催化作用下進行甲酯化修飾，隨后利用正己烷萃取甲酯化產(chǎn)物，萃取樣品采用Sun 等人報道的方法進行脂肪酸分析測定[10]。

1.6 透明質酸濃度測定

采用Bitter-Muir 氏法測定透明質酸濃度[11]。

1.7 透明質酸相對分子質量測定

采用Laurent 特性粘度法測定透明質酸相對分子質量[13]。

2 結果與討論

2.1 Triton X-100 添加濃度對透明質酸發(fā)酵產(chǎn)量和分子量的影響

圖1 Triton X-100 添加濃度對透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)S. equisimilis FE-11 發(fā)酵體系中添加表面活性劑Triton X-100 可以顯著影響透明質酸產(chǎn)量和分子量。如圖1 所示，在發(fā)酵初始階段，向透明質酸的發(fā)酵體系中添加一定量的Triton X-100，考查其添加濃度對透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響。在Triton X-100 添加終濃度從1 g/L 逐步上升至7 g/L 過程中，透明質酸分子量和產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當添加終濃度為3 g/L 時，透明質酸分子量和產(chǎn)量同時達到最高值，分別為1.98 MDa 和1.12 g/L。

2.2 Triton X-100 添加時機對透明質酸發(fā)酵產(chǎn)量和分子量的影響

Triton X-100 對透明質酸發(fā)酵的影響除了與添加濃度有關外，還與添加時機相關。為了考查Triton X-100添加時機對透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響，將Triton X-100 以不同時間（第0 h、4 h、8 h、12 h、16 h）添加到透明質酸發(fā)酵體系中時，添加終濃度均為3 g/L，如圖2 所示，透明質酸分子量呈現(xiàn)出先增加后下降的變化趨勢，最高分子量出現(xiàn)在添加時間為4 h，達到了2.18 MDa；另一方面，透明質酸產(chǎn)量受Triton X-100 添加時機的影響，也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最高值出現(xiàn)在添加時間為8 h 時，達到了1.23 g/L。

Triton X-100 對于S. equisimilis FE-11 發(fā)酵生產(chǎn)透明質酸的影響效果受到添加濃度和添加時機的雙重制約，對透明質酸產(chǎn)量和分子量促進效果最好的添加時機發(fā)生在發(fā)酵過程的前半段。為了更為全面考查Triton X-100 對透明質酸發(fā)酵的影響，進一步系統(tǒng)比較了不同添加時機（第0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）和不同添加濃度（0 g/L、1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L）對應的透明質酸產(chǎn)量和分子量，實驗結果如表1 所示，透明質酸產(chǎn)量和分子量隨著Triton X-100 添加時機和添加濃度變化而變化，二者變化趨勢基本一致，并且Triton X-100 添加時機越早，透明質酸產(chǎn)量和分子量的最高值對應的Triton X-100 添加濃度越??；當添加時機較早時（第0 h 和2 h），透明質酸產(chǎn)量和分子量的最高值對應的Triton X-100 添加濃度均是3 g/L；當添加時機為第4 h 和6 h時，透明質酸產(chǎn)量和分子量的最高值對應添加濃度均是5 g/L；當添加時機為第8 h 和10 h 時，透明質酸產(chǎn)量和分子量的最高值對應添加濃度均為7 g/L；在全部實驗批次中，透明質酸產(chǎn)量和分子量的最高值同時出現(xiàn)在當Triton X-100 添加濃度5 g/L，添加時機為第6 h 時，分別達到了1.35 g/L 和2.33 MDa。

圖2 Triton X-100 添加時機對透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響

表1 Triton X-100 添加濃度和添加時機對透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響

2.3 5 L 發(fā)酵罐水平添加Triton X-100 對透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響

為進一步確認添加Triton X-100 對透明質酸發(fā)酵產(chǎn)量和分子量的影響，在5 L 發(fā)酵罐水平上進行了驗證。如圖3 所示，在發(fā)酵第6 h 添加Triton X-100 至5 g/L，與不添加Triton X-100 相比，透明質酸最終產(chǎn)量和分子量分別從3.65 g/L 和1.93 MDa 提高到4.21 g/L 和2.49 MDa，分別提高了15.34%和29.02%。

圖3 5L 發(fā)酵罐水平添加Triton X-100 對透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響

向微生物培養(yǎng)體系中加入表面活性劑可以改善微生物細胞的通透性，進而促進胞內物質的分泌和合成，這主要是由于表面活性物質改變了微生物細胞膜的流動性[7-8]。微生物細胞膜結構中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率很大程度上決定著細胞膜的流動性，二者比率越小，細胞膜流動性和通透性越強[8,12]。Nelmec 等在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶的過程中，添加Tween-80 顯著降低了細胞膜結構中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率，多聚半乳糖醛酸酶的產(chǎn)量提高了70%[13]。在本實驗中，Triton X-100 的加入引起了S.equisimilis FE-11 細胞膜結構中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比率的變化。如表2 所示（脂肪酸種類由碳原子數(shù)∶不飽和鍵數(shù)表示），與不添加Triton X-100 相比，在發(fā)酵第6 h 添加5 g/L Triton X-100 引起S. equisimilis FE-11 細胞膜脂肪酸組成的變化：不飽和脂肪酸C14∶1，C16∶1，C18∶1，C18∶2 均出現(xiàn)不同程度的升高，而飽和脂肪酸C12∶0，C14∶0，C16∶0，C18∶0 均出現(xiàn)不同程度的降低，由此導致飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率從0.80 降低至0.50，這一變化誘發(fā)了S. equisimilis FE-11 細胞膜流動性和通透性的改變，促進了長鏈透明質酸的跨膜分泌與合成，一定程度上揭示了Triton X-100 對透明質酸產(chǎn)量和分子量影響的內在誘因。

表2 添加Triton X-100 對S. equisimilis FE-11 細胞膜脂肪酸組成的影響

3 結論

Triton X-100 添加對S.equisimilis FE-11 發(fā)酵透明質酸產(chǎn)量和分子量的影響效果與添加量和添加時機相關；發(fā)酵第6 h 添加Triton X-100 至5 g/L 可使透明質酸產(chǎn)量和分子量同時達到最高水平；5 L 發(fā)酵罐驗證結果表明，該添加策略使透明質酸產(chǎn)量和分子量分別提升了15.34%和29.02%；透明質酸產(chǎn)量和分子量的提升伴隨菌體細胞膜結構中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的比率而下降；Triton X-100 添加引起的菌體細胞膜結構改變，改善了細胞膜的流動性和通透性，促進了透明質酸產(chǎn)量和分子量的提高。