楊書婷吳 皓劉 睿孫晶晶韋小翠張 焱程建明?

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省海洋藥物研究開發(fā)中心，江蘇 南京 210023）

珍珠貝主要包括三角帆蚌、馬氏珍珠貝和褶紋冠蚌，其中三角帆蚌是淡水珍珠中養(yǎng)殖最廣品種，馬氏珍珠貝又稱馬氏珠母貝或合浦珠母貝，是目前世界上用于海水珍珠生產的主要貝類，其育珠產量占海水珍珠產量的85% 以上［1］，但每年采集珍珠后其軟體得不到充分利用，造成嚴重的資源浪費［2］?！侗静菥V目》 記載其 “止渴除熱，解酒毒，去眼赤，明目除濕，主婦人勞損下血，除煩解熱毒，血崩帶下”；《食療本草》 記載其 “主大熱，解酒毒，去眼赤，止渴”，具有很好的藥效，所含脂肪酸類成分是主要的能量和營養(yǎng)物質，其中不飽和脂肪酸具有顯著的藥理活性［3-4］。本實驗研究淡水與海水中珍珠貝軟體脂肪酸組成，篩選出優(yōu)勢品種，為進一步開發(fā)其藥用價值提供參考。

1 材料

FA1104 型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；九陽勻漿機（九陽有限公司）；凍干機（美國Labconco 公司）；Milli-Q 超純水機（美國 Millipore 公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SB-2100 旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。正己烷（阿拉丁，批號201406）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號20170912）；三氟化硼乙醚（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；無水硫酸鈉（西隴化工股份有限公司）。

三角帆蚌采于浙江諸暨，貝齡24 個月；馬氏珍珠貝采于廣西北海，貝齡14 個月，經南京中醫(yī)藥大學劉圣金副教授鑒定為正品。

2 方法

2.1 三角帆蚌與馬氏珍珠貝凍干粉制備 取適量軟體置于籃中，瀝干過夜，清洗干凈，勻漿，-20 ℃放置 4 h，轉移至-80 ℃過夜后，冷凍干燥后粉碎，過40 目篩，即得淡黃色珍珠貝凍干粉。

2.2 索氏提取 取珍珠貝凍干粉3 g，加入150 mL 正己烷，索氏提取6 h，提取溶液減壓回收，三角帆蚌油脂得率為3.5%，馬氏珍珠貝油脂得率為6.2%。取適量油脂，分別置于25 mL 試管中，加入10% KOH-CH3OH（80%甲醇）2 mL，在60 ℃水浴中皂化至油珠消失，冷卻后加入2 mL三氟化硼乙醚-甲醇（三氟化硼乙醚 ∶甲醇=1 ∶3），60 ℃水浴甲酯化 30 min，冷卻，加 4 mL 正己烷，5 000 r／min 離心10 min，取上層，水洗至中性。加無水硫酸鈉靜置過夜，正己烷稀釋 2 倍，過 0.22 μm 微孔濾膜，供試品進GC-MS 分析。

2.3 超聲提取 取珍珠貝凍干粉3 g，加入150 mL 正己烷，超聲（40 kHz，300 W）提取30 min，提取溶劑減壓回收，三角帆蚌油脂得率為 3.1%，馬氏珍珠貝油脂得率5.9%。皂化和甲酯化方法同 “2.1”項。

2.4 GC-MS 分析（圖1～4）

2.4.1 GC-MS 條件 Agilent HP-5 色譜柱（0.25 mm×30 mm，0.25 μm）；進樣口溫度 220 ℃；檢測器溫度250 ℃；載氣為高純度氦氣；柱體積流量 1.0 mL／min；進樣時間 1 min；溶劑延遲 3 min；柱起始溫度 110 ℃，保持5 min，然后以 5 ℃ ／min 升溫至 185 ℃ ，再以 5 ℃ ／min 升溫至 280 ℃；采用分流進樣模式，分流比 10 ∶1；進樣 1 μL。

2.4.2 MS 條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度 220 ℃；選取全程離子碎片掃描模式；質量掃描范圍為m／z45～450。

3 結果

三角帆蚌中確定25種脂肪酸，馬氏珍珠貝中確定26種脂肪酸。運用面積歸一化法得出各脂肪酸的相對含有量，結果見表1。

由表可知，三角帆蚌中含有飽和脂肪酸48.25%，以十六烷酸（26.53%）、十七烷酸（5.12%）、硬脂酸（9.15%）為主；含有不飽和脂肪酸（19.45%），以 9-十八碳烯酸（6.94%）、11-二十碳烯酸（7.05%）為主。馬氏珍珠貝中含有飽和脂肪酸 21.92%，以十六烷酸（13.70%）、硬脂酸（4.81%）為主；不飽和脂肪酸55.81% ，以 9，12-十八碳二烯酸（24.60% ）、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（6.41% ）、EPA（6.41% ）、DHA 酸（6.66%）為主。

圖1 三角帆蚌索氏提取脂肪酸GC-MS 總離子流圖

圖2 馬氏珍珠貝索氏提取脂肪酸GC-MS 總離子流圖

圖3 三角帆蚌超聲提取脂肪酸GC-MS 總離子流圖

圖4 馬氏珍珠貝中超聲提取脂肪酸GC-MS 總離子流圖

超聲提取2種珍珠貝軟體中脂肪酸類成分，三角帆蚌中確定24種脂肪酸，馬氏珍珠貝中確定21種脂肪酸。運用面積歸一化法得出各脂肪酸的相對含有量，結果見表2。

由表可知，三角帆蚌中含有飽和脂肪酸40.53%，以十六烷酸（23.65%）、十七烷酸（4.12%）、硬脂酸（7.50%）為主；含有不飽和脂肪酸（23.34%），以 9-十八碳烯酸（7.32%）、13-二十碳烯酸（7.52%）為主。馬氏珍珠貝中含有飽和脂肪酸 29.45%，以十六烷酸（20.11%）、硬脂酸（5.73%）為主；不飽和脂肪酸46.08% ，以9，12-十八碳二烯酸（20.10% ）、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（5.86% ）、EPA（6.41% ）、DHA 酸（3.65%）為主。

4 討論

三角帆蚌和馬氏珍珠貝是淡水與海水養(yǎng)殖珍珠主要品種，馬氏珍珠貝占海水珍珠產量的85%以上。但是貝肉沒有得到充分應用，造成資源浪費。對廢棄的珍珠貝軟體脂肪酸成分研究，為珍珠貝軟體綜合開發(fā)利用提供參考。

脂肪酸主要包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸在營養(yǎng)學和醫(yī)藥方面具有很好的藥理作用［5］?；ㄉ南┧?、EPA 和DHA 等多不飽和脂肪酸可以提高人體免疫力［6］。自然界中大豆油等植物油中含有較多的花生四烯酸，鮭魚和金槍魚等海洋魚類動物中也含有較多的長鏈不飽和脂肪酸［7-9］。不飽和脂肪酸除了作為營養(yǎng)品、保健品、健康輔料和食品添加劑外，對生理功能方面也有作用，尤其對神經系統、視覺系統、智力發(fā)育和心血管病方面有很好的作用［10-11］。

目前，沒有統一的標準和方法對生物體中的脂肪酸進行提取和分析［12］。文章采用傳統的索氏提取和現代化的超聲提取2種方法進行比較。結果顯示，索氏提取與超聲提取整體差異不大。由于索氏提取時間久，對脂肪酸類成分提取更加完全，但操作繁瑣，提取時間久。并且，與超聲提取差異不大。因此，采用更加高效的超聲提取。

對三角帆蚌和馬氏珍珠貝中脂肪酸進行分析，可以看出馬氏珍珠貝中脂肪酸含有量高于三角帆蚌，EPA、DHA含有量顯著高于三角帆蚌。因此，馬氏珍珠貝軟體可以作為提取EPA、DHA 的原料。EPA、DHA 具有促進視網膜形成、抑制血小板聚集、抑制腫瘤生長等作用［13］。三角帆蚌中硬脂酸含有量較高，且硬脂酸是重要的化工原料［14-15］。因此，三角帆蚌和馬氏珍珠貝軟體中脂肪酸均有研發(fā)價值。

表1 三角帆蚌和馬氏珍珠貝脂肪酸成分