吳 艷，杜 娟，張曉雷

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

帕金森病是世界公認(rèn)的第二大神經(jīng)退行性疾病，但機(jī)制尚不明確［1］，其病理特點(diǎn)為腦中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體通路DA 合成減少直至不足，從而引起機(jī)體靜止震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩等運(yùn)動(dòng)癥狀［2］。多巴胺能神經(jīng)元損傷導(dǎo)致多巴胺合成減少是發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［2］，酪氨酸羥化酶（TH）是多巴胺合成限速酶，神經(jīng)元攝取血中酪氨酸后通過(guò)TH 合成多巴，再經(jīng)多巴脫羧酶生成多巴胺以維持正常機(jī)體功能［3］，故TH 的功能和表達(dá)對(duì)多巴胺合成有重要意義［4］。

目前，左旋多巴替代療法是臨床最常用的帕金森病治療方案，它可補(bǔ)充紋狀體中多巴胺不足，對(duì)肌強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)困難療效較好［5］，但使用過(guò)程中因?yàn)檠獫{Hcy 水平升高，易出現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞增生、氧化應(yīng)激反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化形成，甚至失眠、抑郁、幻覺等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［6］，這與長(zhǎng)期使用左旋多巴類藥物療效下降，甚至藥物不良反應(yīng)增加有關(guān)，故該療法有其局限性［7］。參附注射液可緩解氣虛、陽(yáng)虛癥狀，具有抗缺血、缺氧等作用，其主要成分是紅參和附片，可用于治療缺血缺氧導(dǎo)致的心腦血管疾?。?］，本實(shí)驗(yàn)探討該制劑聯(lián)合左旋多巴對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)組織形態(tài)及酪氨酸羥化酶水平的影響，以期為相關(guān)治療提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康 C57／BL6 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0018，飼養(yǎng)于中美冠科生物技術(shù)有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，使用許可證：SYXK（蘇）2014-0047，溫度（22±1）℃、相對(duì)濕度（60±5）%，自由攝食飲水。

1.2 儀器 680 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（上海眾生聲明科學(xué)發(fā)展有限公司）；BSA124S 電子分析天平［塞多利斯科儀器（北京）有限公司］；D3024R 微量高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Scilogex 公司）；ELX808 酶標(biāo)儀（美國(guó) BioTek 公司）；Basic164-5050 電泳電源、TY10165-8001 垂直電泳槽、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；YD-1508A 石蠟切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；Axioplan 2 imaging 光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss Jena 公司）。

1.3 試藥 參附注射液［華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批號(hào)17040205004］；左旋多巴片（浙江遠(yuǎn)力健藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào) 170701）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào) JBVHJCB）；小鼠酪氨酸羥化酶（TH）ELSIA 檢測(cè)試劑盒（武漢伊艾博科技有限公司，批號(hào)2620187320）；Rabbit tyrosine hydroxylase 抗體［愛必信（上海）生物科技有限公司，批號(hào) 34i7370］；Rabbit GAPDH 抗體（美國(guó) Bioworld 公司，批號(hào) AA0101）；goat anti Rabbit IGg（美國(guó) Bioworld 公司，批號(hào)CJ4422）；DAB顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)033016160503）。

2 方法

2.1 分組、給藥、造模 30 只雄性小鼠，隨機(jī)分為 5 組，每組6 只，分別為對(duì)照組（腹腔注射生理鹽水）、模型組（腹腔注射 25 mg／kgMPTP）、參附注射液組（腹腔注射8 mg／kg）、左旋多巴組（灌胃 25 mg／kg）、參附注射液＋左旋多巴組（腹腔注射 8 mg／kg＋灌胃 25 mg／kg）。除對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射25 mg／kg MPTP 7 d 以建立帕金森病模型，給藥14 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠行為學(xué)檢測(cè)

2.2.1 爬桿實(shí)驗(yàn) 選擇50 cm 長(zhǎng)、1 cm 粗的木桿作為爬桿，頂端固定直徑2 cm 的泡沫塑料小球，爬桿上纏繞醫(yī)用膠布以防止打滑。實(shí)驗(yàn)前1 周，每天進(jìn)行1 次爬桿訓(xùn)練，最后1 次給藥后進(jìn)行檢測(cè)，將小鼠放至球頂使其爬下，以小鼠雙前肢接觸桿底平臺(tái)為完成爬桿，記錄爬完所需的時(shí)間。每只小鼠爬桿5 次，取平均值。

2.2.2 懸掛實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前1 周，每天將小鼠2 只前爪懸掛于水平線上停留10 s，給藥結(jié)束后進(jìn)行檢測(cè)。如小鼠在10 s內(nèi)用 2 只后爪抓住線，記 3 分；1 只后爪抓住線，記 2 分；2 只后爪均抓不住線，記 1 分；小鼠跌落，記 0 分。

2.3 血清及腦組織TH 水平檢測(cè) 小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后頸動(dòng)脈取血，脫頸處死，冰上取出黑質(zhì)區(qū)新鮮腦組織置于凍存管中，液氮速凍后，放入-80 ℃冰箱中保存。ELISA 試劑盒檢測(cè)血清及黑質(zhì)區(qū)腦組織TH 水平，具體操作方法參考說(shuō)明書。

2.4 組織切片及染色 小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后頸動(dòng)脈取血，脫頸處死，冰上取出大腦，迅速放入多聚甲醛溶液中固定，制備蠟塊，切片后脫蠟復(fù)水，HE 染色，脫水后封片，光鏡觀察。再免疫組化染色，切片復(fù)水后，3% H2O2中滅活組織切片中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，清洗后進(jìn)行抗原修復(fù)，山羊血清滴封閉，一抗4 ℃下過(guò)夜，二抗37 ℃下孵育1 h，滴加DAB顯色液染色，蘇木素復(fù)染，脫水后封片，光鏡觀察。通過(guò)Image pro plus 軟件統(tǒng)計(jì)各圖片中蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，Excel 軟件處理，SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5 大腦黑質(zhì)組織TH 蛋白水平檢測(cè) 采用Western blot法。精密稱取小鼠腦組織，裂解，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白的分子量制備合適濃度的SDS-PAGE 凝膠，加樣后通電，進(jìn)行垂直電泳，蛋白被適當(dāng)分離后停止，冰浴，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉 1 h 以上，加入稀釋好的一抗，4 ℃擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜，加入稀釋好的二抗，室溫下孵育2 h，洗滌3 次，采用凝膠成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像，拍照并保存。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組內(nèi)或組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參附注射液對(duì)小鼠行為學(xué)的影響 表1顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠爬桿時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），懸掛實(shí)驗(yàn)得分顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠爬桿時(shí)間顯著縮短（P＜0.05，P＜0.01），懸掛實(shí)驗(yàn)得分顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 參附注射液對(duì)小鼠行為學(xué)的影響（， n=6）

表1 參附注射液對(duì)小鼠行為學(xué)的影響（， n=6）

注：與對(duì)照組比較，## P＜0.01；與模型組比較，? P＜0.05，??P＜0.01

組別 爬桿時(shí)間／s 懸掛實(shí)驗(yàn)得分／分對(duì)照組 7.8±1.3 2.5±0.3模型組 15.7±1.4## 0.8±0.5##參附注射液組 11.1±1.3? 1.8±0.6??左旋多巴組 10.8±1.6? 1.9±0.7??參附注射液＋左旋多巴組 9.7±1.9?? 2.0±0.8??

3.2 參附注射液對(duì)小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的影響 圖1顯示，對(duì)照組小鼠黑質(zhì)致密度神經(jīng)元數(shù)量豐富，胞體較大，多為橢圓形，胞漿染色較淡，細(xì)胞核染清晰；模型組小鼠部分神經(jīng)元胞體深染，膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元數(shù)目減少；參附注射液組、左旋多巴組視野內(nèi)小鼠黑質(zhì)正常神經(jīng)元平均數(shù)量均明顯高于模型組，形態(tài)上可觀察到2 組黑質(zhì)殘存的神經(jīng)元較多，細(xì)長(zhǎng)、胞體深染的神經(jīng)元數(shù)量較少，膠質(zhì)細(xì)胞增生得到改善；參附注射液＋左旋多巴組小鼠黑質(zhì)正常神經(jīng)元數(shù)目?jī)H次于對(duì)照組，少部分黑質(zhì)細(xì)胞黑色素減少，少部分神經(jīng)元胞體深染，胞核濃染。

圖1 各組小鼠黑質(zhì)HE 染色

3.3 參附注射液對(duì)TH 水平的影響 表2顯示，與對(duì)照組比較，模型組TH 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組其水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 參附注射液對(duì)TH 水平的影響（， n=6）

表2 參附注射液對(duì)TH 水平的影響（， n=6）

注：與對(duì)照組比較，## P＜0.01；與模型組比較，? P＜0.05，??P＜0.01

組別 血清 TH／（pg·mL-1）黑質(zhì) TH／（ng·g-1）對(duì)照組 1 443.5±137.6 3.012±0.268模型組 621.0±78.4## 1.359±0.144##參附注射液組 912.8±103.1? 2.217±0.192??左旋多巴組 986.4±96.9? 2.109±0.255??參附注射液＋左旋多巴組 1 145.5±112.3?? 2.538±0.245??

3.4 參附注射液對(duì)TH 蛋白表達(dá)的影響 圖2顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦黑質(zhì)區(qū)TH 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組其蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

4 討論

流行病學(xué)調(diào)查表明，在60 歲以上人群中帕金森病患病率為1%，并且每年新增患者 10 萬(wàn)以上［9］，既往臨床研究表明，左旋多巴制劑可引起周圍性、中樞性2 類不良反應(yīng)［10］，故減少及延遲其不良反應(yīng)發(fā)生，改善其對(duì)腦中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用，是臨床關(guān)注熱點(diǎn)。帕金森病主要病理基礎(chǔ)是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，造成TH表達(dá)和數(shù)量下降，最終導(dǎo)致合成減少黑質(zhì)-紋狀體多巴胺濃度不足，引起運(yùn)動(dòng)癥狀［11］，目前還沒有針對(duì)多巴胺能神經(jīng)損傷的保護(hù)藥物。

圖2 參附注射液對(duì)TH 蛋白表達(dá)的影響

中醫(yī)認(rèn)為，帕金森病屬于 “顫證”“痹癥”范疇，因?yàn)樾帮L(fēng)、邪熱、邪濕阻滯經(jīng)絡(luò)，加之老年人氣血不足，難以溫養(yǎng)筋脈；病久入絡(luò)，瘀血內(nèi)阻，血行不暢，導(dǎo)致肢體震顫、痙攣、麻痹等癥狀，主病在肝，病久涉及脾胃，其病位在腦髓、筋脈，表明該疾病發(fā)生不僅與肝之疏泄失常、脾虛失運(yùn)有聯(lián)系，也與老年人氣血兩虛密切相關(guān)［12］。中藥具有安全性高的優(yōu)勢(shì)，在帕金森病臨床治療中受到越來(lái)越多的重視，如銀杏平顫方、肉蓯蓉等［13-14］；參附注射液含有人參和附片。臨床研究顯示其對(duì)神經(jīng)、心血管、免疫系統(tǒng)功能具有不同程度的保護(hù)作用［8，15］，其中人參皂苷是人參主要活性成分，參附注射液中其含有量＞0.8 mg／mL，可通過(guò)激活神經(jīng)細(xì)胞存活機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，從而發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育、調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)、改善學(xué)習(xí)與記憶能力的作用［16］，還有抗疲勞、增強(qiáng)心肌功能，能保護(hù)自身免疫系統(tǒng)，促進(jìn)物質(zhì)代謝和抗氧化，同時(shí)可提高機(jī)體適應(yīng)性，有升壓、穩(wěn)壓等作用［17］；附片所含烏頭堿可興奮迷走神經(jīng)加快心率，有明顯升血壓的作用，對(duì)陽(yáng)虛、痹癥有效。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MPTP 致小鼠帕金森模型，研究參附注射液?jiǎn)为?dú)應(yīng)用及聯(lián)合左旋多巴時(shí)對(duì)帕金森病小鼠的治療作用。結(jié)果顯示，參附注射液可明顯縮短小鼠爬桿時(shí)間，提高小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)得分；參附注射液、左旋多巴及兩者聯(lián)用時(shí)均對(duì)小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，并且能明顯提高血清、大腦黑質(zhì)區(qū)TH 水平及黑質(zhì)區(qū)TH 蛋白表達(dá)，以聯(lián)合應(yīng)用更強(qiáng)，表明參附注射液對(duì)帕金森病小鼠有較好的治療效果，而且聯(lián)合左旋多巴時(shí)作用更強(qiáng)。