虞夏暉，朱雨晴，王于俊，徐義培，郭 瑩

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

缺血性腦卒中即為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的缺血性腦血管病，是指血管阻塞引起腦缺血、缺氧損傷進(jìn)而導(dǎo)致局灶或全腦的功能障礙，具有發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康［1］。目前為止，臨床上的首要治療原則是使缺血腦組織盡早恢復(fù)或再通血液灌注，重新獲得血氧供應(yīng)，但這些治療措施在使閉塞腦血管再通的同時(shí)常使缺血組織病理損害加重甚至不可逆，臨床癥狀惡化，這種現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷［2］。近年來研究表明，腸道菌群在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［3-4］。Benakis 等［5］報(bào)道腸道菌群可通過調(diào)節(jié)腸道 γδT 細(xì)胞，從而影響缺血性腦卒中的損傷。

大黃是我國傳統(tǒng)的四大中藥之一，具有瀉下通便、活血逐瘀等多種功效［6］，蒽醌苷作為其中主要的有效成分，對大鼠腦缺血損傷具有顯著保護(hù)作用［7］，但其防治機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)代研究表明，蒽醌苷類成分難以吸收，大多滯留于腸道發(fā)揮藥效作用［8］，大黃蒽醌苷對腦缺血性損傷的治療作用可能和其在腸道的位置有關(guān)，也有文獻(xiàn)形式中藥苷類成分藥效的發(fā)揮和腸道菌群的相互作用有關(guān)［9-10］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究大黃蒽醌苷對腦缺血再灌注損傷大鼠的治療效果，并比較該成分對腸道菌群的影響，探討其抗腦缺血性損傷機(jī)制與腸道菌群的相關(guān)性。

1 材料

1.1 動物 健康清潔級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（280±20）g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2014-0001。

1.2 試藥 藥用大黃Rheum officinaleBaill（浙江天道醫(yī)藥有限公司，批號 170302）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、乳酸（LD）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；TTC 染料（美國 Sigma 公司）；伊紅美蘭培養(yǎng)基（EMB）、膽鹽-七葉苷-疊氮鈉瓊脂、雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（BBL）、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基（LBS）（青島海博生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 SpectraMax M3 酶標(biāo)儀（美國 MD 公司）；FA2 104N 電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；DRP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SW-CJ-2G 型雙人凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法

2.1 分組與給藥 乙醇回流提取法得到蒽醌粗提取物，再以70%甲醇，葡聚糖凝膠LH-20 柱色譜純化得到蒽醌苷提取物［11］，按后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求用蒸餾水將提取物配制成不同質(zhì)量濃度。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及大黃蒽醌苷高、中、低劑量組（30、15、7.5 m／kg），每組 9 只。大鼠腦缺血再灌注同時(shí)灌胃給藥，連續(xù) 7 d，1 次／d，假手術(shù)組、模型組大鼠灌服等量生理鹽水。

2.2 模型建立 大鼠稱定質(zhì)量后，腹腔注射10%水合氯醛（劑量 300 mg／kg）麻醉，參考 Longa 等［12］報(bào)道的方法建立大腦中動脈局灶性栓塞（MCAO）模型，假手術(shù)組大鼠不插栓線。缺血60 min 后抽出栓線，松開頸總動脈夾作再灌注，以大鼠蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner 征和對側(cè)前肢提爪為造模成功。

2.3 神經(jīng)功能評分 大鼠灌胃給藥7 d 后，參考Longa等［12］報(bào)道的5 分制評分法進(jìn)行評分：無精神損傷癥狀，為0 分；不能完全伸展對側(cè)前爪，為1 分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，為 2分；向?qū)?cè)傾倒，為 3 分；不能自發(fā)行走，意識喪失，為4 分。

2.4 腦梗死范圍百分比測定 大鼠灌胃給藥7 d 后麻醉，斷頭取腦，生理鹽水沖洗殘血，-20 ℃下速凍20 min，置于腦槽中切片，TTC 染色，Image J 軟件測定腦梗死范圍百分比。

2.5 腦組織指標(biāo)檢測 取大鼠缺血側(cè)腦組織，稱定質(zhì)量后加生理鹽水制成10%組織勻漿，3 000 r／min 離心10 min，取上清液，-20 ℃下保存。按試劑盒說明操作步驟測定腦組織中 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β、TNF-α 水平。

2.6 腸道菌群檢測［13］分別在灌胃給藥 1、7 d 后，無菌條件下收集大鼠糞便，各組取0.1 g，置于裝有玻璃珠的無菌試管中，按1 ∶9 比例加入滅菌生理鹽水渦旋振蕩至糞便均勻化，10 倍稀釋法用生理鹽水將糞便懸液依次稀釋至10-8濃度。選用合適的稀釋液作為腸道菌群檢測液進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，取50 μL 適宜稀釋度的菌懸液接種于各選擇性培養(yǎng)基上，涂布均勻，平行3 次，大腸桿菌和腸球菌于37 ℃下培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌于37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，以菌落形態(tài)、革蘭氏染色和生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌，計(jì)算各平板上菌落數(shù)，結(jié)果以每1 g 糞便中菌落數(shù)的對數(shù)值表示（l g CFU／g）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）和 LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃蒽醌苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響 表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組大鼠其評分顯著降低（P＜0.01）。

表1 大黃蒽醌苷對大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死范圍百分比的影響（， n=9）

表1 大黃蒽醌苷對大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死范圍百分比的影響（， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）神經(jīng)功能評分／分腦梗死范圍百分比／%假手術(shù)組 — 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 — 2.44±0.53?? 26.79±4.38??大黃蒽醌苷低劑量組 7.5 2.00±0.71 23.64±3.64大黃蒽醌苷中劑量組 15 1.50±0.85△△ 16.97±1.69△△大黃蒽醌苷高劑量組 30 1.22±0.67△△ 9.65±1.55△△

3.2 大黃蒽醌苷對大鼠腦梗死范圍百分比的影響 表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死范圍百分比顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組大鼠其百分比顯著降低（P＜0.01）。然后，大鼠斷頭取腦，TTC 染色，測定腦梗死體積，結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色

3.3 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響 表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組 SOD 活性顯著降低（P＜0.01），NO、LD、MDA 水平及 NOS、LDH 活性顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組上述指標(biāo)顯著改善（P＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯。

表2 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響（， n=9）

表2 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響（， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 SOD／（U·mg prot-1）MDA／（nmol·mg prot-1 ）LD／（mmol·g prot-1 ）LDH／（U·mg prot-1）NO／（μmol·g prot-1 ）NOS／（U·mg prot-1）假手術(shù)組 327.95±47.57 1.84±0.38 1.05±0.28 13.77±5.09 12.44±1.86 2.54±0.72模型組 193.92±38.10?? 4.61±1.15?? 2.03±0.49?? 23.75±3.09?? 18.08±2.92?? 3.65±0.29??大黃蒽醌苷低劑量組 220.15±22.71 4.10±1.19 2.11±0.46 23.74±2.55 15.52±1.98 3.45±0.35大黃蒽醌苷中劑量組 272.77±48.03△△ 2.34±0.70△△ 1.55±0.42 19.78±2.43 14.70±1.63△ 2.97±0.51△大黃蒽醌苷高劑量組 296.49±36.72△△ 2.03±0.48△△ 1.32±0.24△ 17.10±3.32△ 13.04±2.73△△ 2.67±0.68△△

3.4 大黃蒽醌苷對 IL-1β、TNF-α 水平的影響 表3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組 IL-1β、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組兩者水平顯著降低（P＜0.01）。

表3 大黃蒽醌苷對IL-1β、TNF-α水平的影響（， n=9）

表3 大黃蒽醌苷對IL-1β、TNF-α水平的影響（， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）IL-1β／（pg·mL-1）假手術(shù)組 — 234.56±36.70 188.67±30.60模型組 — 363.33±67.47?? 280.74±54.55??大黃蒽醌苷低劑量組 7.5 320.56±55.03 226.83±42.90大黃蒽醌苷中劑量組 15 271.89±42.46△△ 202.22±27.62△△大黃蒽醌苷高劑量組 30 265.74±39.28△△ 202.41±30.94△△TNF-α／（pg·mL-1）

表4 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響（lgCFU／g，， n=9）

表4 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響（lgCFU／g，， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

時(shí)間／d 組別 大腸桿菌 腸球菌 乳酸桿菌 雙歧桿菌1假手術(shù)組 6.21±0.46 4.71±0.38 7.22±0.15 7.97±0.19模型組 7.78±0.23?? 6.82±0.26?? 6.26±0.23?? 6.98±0.19??大黃蒽醌苷低劑量組 7.81±0.11 6.71±0.21 6.33±0.34 7.28±0.17△大黃蒽醌苷中劑量組 7.56±0.26 6.46±0.17 6.38±0.27 7.38±0.17△大黃蒽醌苷高劑量組 7.09±0.20 6.14±0.07△△ 6.72±0.14△ 7.58±0.11△△7假手術(shù)組 6.28±0.44 4.82±0.13 7.28±0.24 7.99±0.23模型組 8.40±0.09?? 7.75±0.16?? 5.77±0.20?? 6.39±0.06??大黃蒽醌苷低劑量組 7.89±0.48△ 7.33±0.33△ 5.90±0.21 7.36±0.23△△大黃蒽醌苷中劑量組 7.15±0.30△△ 6.65±0.21△△ 6.50±0.25△△ 7.61±0.07△△大黃蒽醌苷高劑量組 6.35±0.30△△ 5.60±0.30△△ 6.83±0.21△△ 7.82±0.15△△

3.5 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響 表4顯示，給藥1 d后與假手術(shù)組比較，模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著升高（P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷低、中劑量組雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著升高（P＜0.05），高劑量組能顯著抑制腸球菌生成，促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌生成（P＜0.05，P＜0.01）。給藥 7 d 后與假手術(shù)組比較，模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著升高（P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷組（除低劑量組對乳酸桿菌無顯著影響外）顯著抑制大腸桿菌、腸球菌生成（P＜0.05，P＜0.01），促進(jìn)乳酸桿菌、雙歧桿菌生成（P＜0.01）。

圖2顯示，假手術(shù)組中4種菌菌落數(shù)的對數(shù)值無明顯變化（P＞0.05）；模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著上升，乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；大黃蒽醌苷組隨著劑量增加，大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值呈下降趨勢，乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值逐漸增加。

4 討論

近年來，“菌-腸-腦”軸概念的提出為研究腸道菌群與腦卒中預(yù)后提供新的思路和方法，腸道可通過內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、迷走神經(jīng)、一些胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)等與大腦相互作用［14-15］，越來越多的研究表明，腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。本實(shí)驗(yàn)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值明顯增加，乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著減少，而大黃蒽醌苷可顯著逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，表明大鼠腦缺血再灌注損傷后腸道正常微生態(tài)平衡受到破壞，而大黃蒽醌苷可使腦缺血后腸道菌群失衡狀態(tài)得到一定改善。

缺血性腦卒中可引發(fā)腸道微生物紊亂，損害胃腸道菌群的功能；反之，腸道微生物改變也會通過炎癥反應(yīng)等來影響大腦損傷的預(yù)后［3］。國外報(bào)道顯示，腸道菌群可有效調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量，如調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）和 γ δ T 細(xì)胞，其失調(diào)會對 Treg 細(xì)胞和白細(xì)胞介素（IL）17＋γδT 細(xì)胞產(chǎn)生影響，并且兩者均參與缺血性腦損傷［17］；Benakis等［5］在IS 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷急性期后Treg 細(xì)胞在缺血組織出現(xiàn)，并分泌大量抗炎細(xì)胞因子（IL-10），進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用；卒中發(fā)生后腸道菌群從胃腸道轉(zhuǎn)移到胃腸道以外的器官，應(yīng)激狀態(tài)也能促進(jìn)菌群由消化道轉(zhuǎn)移至血液，從而誘發(fā)系統(tǒng)的免疫和炎癥反應(yīng)［18］，而免疫和炎癥反應(yīng)已被證實(shí)是腦缺血損傷發(fā)生機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［17］。本實(shí)驗(yàn)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α 水平明顯提高，而大黃蒽醌苷可有效降低，表明該成分能有效抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善腦缺血再灌注損傷。

正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡時(shí)，將導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生更多的活性氧（ROS）［19］；SOD 為人體最重要的自由基清除劑，但過多的氧自由基將大量消耗該因子，從而降低其活性［20］，而大量 ROS 能攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 大量產(chǎn)生，損傷組織 DNA［21］；NO 以L-精氨酸為底物，在一氧化氮合酶（NOS）催化下產(chǎn)生［22］。研究表明，腸道菌群的紊亂、移位可導(dǎo)致腸道內(nèi)毒素大量產(chǎn)生，內(nèi)毒素又可通過誘導(dǎo)NOS合成NO，后者過量時(shí)可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［23］。本實(shí)驗(yàn)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD 活性降低，MDA、NO 水平升高，而大黃蒽醌苷可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。

LD 是腸道菌群固有的產(chǎn)物，腸道菌群失調(diào)大量繁殖會導(dǎo)致其水平明顯升高，進(jìn)而促進(jìn) LDH 活性提高［24］。本實(shí)驗(yàn)顯示，腦缺血損傷提高大鼠腦組織LD 水平、LDH 活性，表明過多的LD 會損傷腦組織。

圖2 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響

蒽醌苷作為常見糖苷類物質(zhì)，由于其苷類結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而在機(jī)體腸道中難以直接吸收利用，需要通過與腸道菌群的相互作用來發(fā)揮藥效［9］。本實(shí)驗(yàn)推測大黃蒽醌苷可能通過調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷大鼠腸道菌群，維護(hù)腸道微生態(tài)平衡，從而緩解炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷等，并改善腦缺血性損傷。但目前還無法確認(rèn)腸道菌群在大黃蒽醌苷治療大鼠腦缺血性損傷中是否起到主導(dǎo)作用，尚有待進(jìn)一步研究。