李思雨，張冬月，韓 麗，張 慧

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

通關(guān)藤為蘿藦科牛奶菜屬植物通關(guān)藤M(fèi)arsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤莖，最早記載于 《滇南本草》，主產(chǎn)于云南、貴州、廣西等地，其味苦，性微寒，具有抗腫瘤、清熱解毒等作用，由通關(guān)藤為原料制成的消癌平制劑臨床應(yīng)用廣泛［1-3］，用于治療胃癌、食管癌、肝癌等消化道腫瘤［4］，主要藥效物質(zhì)是C21甾體皂苷類化合物［5］。目前，有關(guān)通關(guān)藤及其制劑的含有量測(cè)定方法大多以2015年版 《中國(guó)藥典》 收載的HPLC-ELSD 法測(cè)定通關(guān)藤H 為主，而且也有報(bào)道采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定通關(guān)藤苷 G、I［6］，或通關(guān)藤苷 A、D 含有量［7］，UPLC-MS／MS 法測(cè)定通關(guān)藤苷 A、H、I 含有量［8］，HPLC-ELSD 法測(cè)定通關(guān)藤皂苷 L、M、N、O、P 含有量［9］，HPLC-UV 法測(cè)定通關(guān)藤苷 A 含有量［10］，比色法測(cè)定總皂苷含有量［11-14］等，但尚無HPLC-DAD-ELSD 聯(lián)用方法同時(shí)測(cè)定具有紫外吸收的通關(guān)藤苷G、I 及無紫外吸收的通關(guān)藤H 含有量。為了開發(fā)抗腫瘤新藥原料，并更好控制其提取物質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-DAD-ELSD 法同時(shí)測(cè)定22 個(gè)產(chǎn)地通關(guān)藤中通關(guān)藤苷G、H、I 的含有量，為相關(guān)新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（配置真空脫氣機(jī)、四元泵及 DAD、ELSD 檢測(cè)器）；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JP60-4 型電子分析天平（沈陽市龍騰電子有限公司）；CP225D 型電子分析天平（十萬分之一，德國(guó) Sartorius 公司）；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 通關(guān)藤苷H（批號(hào)111913-201202）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；通關(guān)藤苷 G（批號(hào)PM0529SA13）、通關(guān)藤苷 I（批號(hào) PM0529SB13）對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。甲醇為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙腈為色譜純（天津星馬克科技發(fā)展有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 藥材 22 個(gè)產(chǎn)地通關(guān)藤均為實(shí)地采集，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張慧教授鑒定為蘿藦科牛奶菜屬植物通關(guān)藤M(fèi)arsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤莖。藥材經(jīng)70%乙醇提取后，濃縮干燥。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（45 ∶55）；體積流量1.0 mL／min；柱溫 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；進(jìn)樣量20 μL。ELSD 參數(shù)為漂移管溫度80 ℃；載氣壓力3.5 bar（1 bar=100 kPa）；增益值 5。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取通關(guān)藤苷G、H、I 對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，即得（三者質(zhì)量濃度分別為 0.841、1.921、1.513 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 將提取物置于量瓶中，70%乙醇稀釋至 0.15 g／mL，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取70%乙醇，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取供試品、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液各20 μL，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，見圖1。可知，陰性對(duì)照溶液色譜圖中未見與對(duì)照品溶液中3種成分保留時(shí)間相同的色譜峰，表明陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC-DAD-ELSD 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，置于 5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。其中，通關(guān)藤苷G、I（DAD）以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸；通關(guān)藤苷H（ELSD）以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。結(jié)果，通關(guān)藤苷 G、H、I 方程分別為Y= 1 092X-317.76（r=0.999 2）、Y=1.139 5X＋4.471（r=0.999 0）、Y=472.89X-651.48（r=0.999 1），分別在 1.768～5.305、3.842～11.526、3.026～9.078 μg 范 圍 內(nèi)呈良 好 的 線 性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液20 μL，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得通關(guān)藤苷G、H、I 峰面積RSD 分別為0.94%、1.96%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取云南產(chǎn)藥材粉末6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得通關(guān)藤苷 G、H、I 含有量 RSD 分別為1.54%、1.90%、1.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液 20 μL，于 0、2、4、6、8 h 在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得通關(guān)藤苷 G、H、I 峰面積 RSD 分別為 0.94%、1.91%、1.80%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密加入通關(guān)藤苷G 對(duì)照品溶液（0.841 mg／mL）2.0 mL、通關(guān)藤苷H對(duì)照品溶液（0.102 4 mg／mL）3.0 mL、通關(guān)藤苷 I 對(duì)照品溶液（1.513 mg／mL）2.5 mL，置于同一量瓶中，平行 6 批，揮干溶劑，加入各成分含有量已知的提取物，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含有量測(cè)定 分別取22 個(gè)產(chǎn)地提取物，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 2015年版 《中國(guó)藥典》 一部中，通關(guān)藤含有量測(cè)定成分僅選擇通關(guān)藤苷H，難以準(zhǔn)確反映其藥效。課題組前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通關(guān)藤苷 G、H、I 具有明顯抗腫瘤作用，故本實(shí)驗(yàn)選擇三者作為指標(biāo)成分。

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)曾采用 40 ∶60、47 ∶53、50 ∶50等比例的乙腈-水流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在45 ∶55 時(shí)通關(guān)藤苷G、H、I 分離效果最好，峰形最佳。由于通關(guān)藤苷 G、I 有紫外吸收，而通關(guān)藤苷 H 無紫外吸收，故本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD-ELSD 法，并且發(fā)現(xiàn)該方法靈敏度高，重復(fù)性好。

3.3 含有量分析 除廣西、四川2 個(gè)批次外，其他20 個(gè)產(chǎn)地通關(guān)藤70% 乙醇提取物中通關(guān)藤苷H 含有量均符合2015年版 《中國(guó)藥典》 不得低于0.12%的規(guī)定；不同產(chǎn)地提取物中通關(guān)藤苷G、H、I 含有量差異明顯，其中通關(guān)藤苷H 可達(dá)33 倍，并且通關(guān)藤苷I 普遍高于其他2種成分，表明多成分同時(shí)測(cè)定可更全面科學(xué)地評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量。