陳 敏，王翠紅

（上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院藥劑科，上海 201318）

羅漢果Siraitia grosvenorii是我國(guó)特有藥食同源植物，主要分布于廣西、廣東、湖南等省，其果實(shí)在我國(guó)已有三百多年的應(yīng)用歷史［1］，《中國(guó)藥典》 記載其味甘、涼，歸肺、大腸經(jīng)，具有清熱潤(rùn)肺、利咽開(kāi)音、滑腸通便的作用，用于治療肺熱燥咳、咽痛失音、腸燥便秘［2］。現(xiàn)代藥理研究表明，羅漢果甜苷具有調(diào)節(jié)血糖平衡、調(diào)節(jié)脂肪代謝、抗氧化及提高免疫等多種生物活性［3-5］；羅漢果中主要含有葫蘆烷型三萜皂苷、黃酮苷、多糖等成分，其主要活性成分是葫蘆烷型三萜苷類化合物，稱為羅漢果苷［6-8］，它們因甜度高、熱量低、色澤淺、穩(wěn)定性好、食用安全，可作為甜味劑全部或部分替代蔗糖而廣泛用于各類食品，在藥食兩用中藥、功能食品、食品添加劑等方面前景廣闊。

本實(shí)驗(yàn)擬選取羅漢果主要有效成分羅漢果皂苷V 含有量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化羅漢果皂苷提取工藝，并通過(guò)小鼠氨水引咳法、小鼠氣管酚紅法測(cè)定提取物止咳祛痰作用，為該藥材開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Varian Cary 100 紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司）；FA2004 電子天平（上海市安亭電子儀器廠）；ME204E 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇科興儀器廠）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥 羅漢果皂苷V 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含有量≥98%）。羅漢果購(gòu)自上海萬(wàn)仕誠(chéng)有限公司，經(jīng)專家鑒定符合2015年版 《中國(guó)藥典》 一部項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純化水。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí) ICR 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量 18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食與飲水，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度 40%～60%，人工照明模擬晝夜變化。本實(shí)驗(yàn)方案遵守動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則及相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液制備 稱取藥材粉末10 g，置于具塞試管中，加水提取，過(guò)濾，定容，即得。

2.2 總皂苷含有量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取羅漢果苷V 對(duì)照品5.26 mg，加入 10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，即得（0.526 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取羅漢果提取液10 mL，水飽和正丁醇溶液萃取 3 次，每次 10 mL，水浴揮干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?50 mL 量瓶中，搖勻，即得。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 精密量取對(duì)照品、供試品溶液各0.5 mL 于10 mL 具塞比色管中，水浴揮干甲醇，加入新鮮配制的 5% 香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸 0.8 mL，60 ℃水浴中加熱15 min 后置于冰水中冷卻3 min，再加5 mL 冰醋酸。以第 1 管為空白對(duì)照，在 200～600 nm 波長(zhǎng)處掃描，發(fā)現(xiàn)在477 nm 處對(duì)照品、供試品溶液均有最大吸收，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 10 mL 具塞比色管中，水浴揮干甲醇，加入新鮮配制的5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴中加熱15 min 后置于冰水中冷卻3 min，再加5 mL 冰醋酸，以第 1 管做空白對(duì)照，于 477 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A= 0.006 3X-0.131（R2=0.999 4），在 34～105 mg／L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液 6 份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，測(cè)得其 RSD 為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液 6 份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法顯色，以空白溶劑為對(duì)照，于 0、1、2、4、8、12 h 測(cè)定吸光度，測(cè)得其 RSD 為 0.3% ，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 量取羅漢果皂苷含有量已知的提取液5 份，加入羅漢果皂苷 V 對(duì)照品溶液，按 “2.2.4”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，羅漢果皂苷平均加樣回收率為97.66%，RSD 為0.63%。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 浸泡時(shí)間 精密稱取15 份樣品粉末于具塞試管中，每份 10 g，加入 15 倍量水，每 3 份設(shè)置浸泡時(shí)間 0、30、60、90、120 min，提取時(shí)間 60 min，計(jì)算羅漢果皂苷含有量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，羅漢果皂苷含有量隨浸泡時(shí)間增加而提高，但超過(guò)90 min 后趨勢(shì)不明顯，故選擇30、60、90 min 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)羅漢果皂苷含有量的影響

2.3.2 料液比 精密稱取12 份藥材粉末于試管中，每份10 g，每 3 份設(shè)置料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25，浸泡時(shí)間 60 min，提取時(shí)間 60 min，計(jì)算羅漢果皂苷含有量，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，羅漢果皂苷含有量在料液比1 ∶5～1 ∶20 時(shí)提高，但超過(guò) 1 ∶20 后不再增加，故選擇 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)羅漢果皂苷含有量的影響

2.3.3 提取時(shí)間 精密稱取15 份藥材粉末于試管中，每份 10 g，加入 15 倍量水，每 3 份設(shè)置提取時(shí)間 30、60、90、120、150 min，浸泡時(shí)間 60 min，計(jì)算羅漢果皂苷含有量，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，羅漢果皂苷含有量在提取時(shí)間30～120 min 時(shí)提高，但超過(guò)90 min 后趨勢(shì)不明顯，故選擇 30、60、90 min 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)羅漢果皂苷含有量的影響

2.3.4 提取次數(shù) 精密稱取3 份藥材粉末于試管中，每份10 g，加入 15 倍量水，浸泡時(shí)間 60 min，提取時(shí)間 60 min，過(guò)濾，得到第1 次提取后的浸提液和濾渣，重復(fù)2 次，將4次浸提液分別編號(hào)，計(jì)算羅漢果總皂苷含有量，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，羅漢果總皂苷含有量隨著提取次數(shù)增加而明顯降低，故選擇 1、2、3 次進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 提取次數(shù)對(duì)羅漢果皂苷含有量的影響

2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、浸泡時(shí)間（D）作為影響因素，羅漢果皂苷V 含有量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，L9（34）正交表優(yōu)化提取工藝。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

由此可知，各因素影響程度依次為料液比＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞浸泡時(shí)間，其中料液比對(duì)羅漢果皂苷V 含有量有顯著影響（P＜0.05），最優(yōu)工藝為 A2B2C3D2?？紤]到浸泡時(shí)間的影響程度最低，并結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際情況和成本，將最優(yōu)工藝修正為 A2B2C3D1，即藥材加 15 倍量水浸泡30 min 后提取 3 次，每次 60 min。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按 “2.4”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表5 羅漢果提取物對(duì)小鼠咳嗽潛伏期、3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響（， n=10）

表5 羅漢果提取物對(duì)小鼠咳嗽潛伏期、3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)的影響（， n=10）

注：與空白組比較，?P＜0.05

組別 劑量 咳嗽潛伏期／s 3 min 咳嗽次數(shù)／次 止咳率／%空白組 20 mL／kg 73.48±23.81 5.18±1.26 —陽(yáng)性對(duì)照組 30 mg／kg 100.47±45.39? 2.05±2.76 65.34羅漢果提取物低劑量組 25 g／kg 92.09±61.29 4.79±6.41 29.37羅漢果提取物高劑量組 50 g／kg 103.62±51.4? 2.87±2.32? 47.32

2.6 止咳祛痰作用測(cè)定

2.6.1 小鼠氨水引咳法 40 只小鼠隨機(jī)分為空白組（等溶劑蒸餾水）、陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方磷酸可待因）及羅漢果提取物低、高劑量組（25、50 g／kg），每組 10 只，灌胃給藥，給藥體積 0.02 mL／g，1 次／d，連續(xù) 5 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。末次給藥1 h 后，將小鼠放入加有濃氨水的多功能誘咳引喘儀中霧化20 s，記錄咳嗽潛伏期（從噴霧開(kāi)始至發(fā)生咳嗽的時(shí)間）、3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，與空白組比較，羅漢果提取物高劑量組小鼠咳嗽潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

2.6.2 小鼠氣管酚紅法 40 只小鼠隨機(jī)分為空白組、氯化銨組（15 mg／kg）及羅漢果提取物低、高劑量組（25、50 g／kg），每組 10 只，灌胃給藥，給藥體積 0.02 mL／g，1 次／d，連續(xù) 5 d，末次給藥前禁食不禁水 12 h。末次給藥1 h 后，小鼠腹腔注射 0.5% 酚紅溶液（0.01 mL／g），1 h 后處死，剝離氣管周圍組織，剪下甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，置于含有2 mL 生理鹽水的試管中，加入0.1 mL 5%碳酸氫鈉溶液，離心 30 min，分離上清液，546 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表6。由表可知，與空白組比較，羅漢果提取物組酚紅質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05），以高劑量組更明顯。

表6 羅漢果提取物對(duì)小鼠氣管酚紅分泌量的影響（，n=10）

表6 羅漢果提取物對(duì)小鼠氣管酚紅分泌量的影響（，n=10）

注：與空白組比較，?P＜0.05

組別 劑量 酚紅／（mg·L-1）空白組 20 mL／kg 4.23±0.84氯化銨組 15 mg／kg 6.25±2.17羅漢果提取物低劑量組 25 g／kg 6.06±0.95?羅漢果提取物高劑量組 50 g／kg 6.33±1.57?

3 討論

羅漢果皂苷為葫蘆烷型三萜烯葡萄糖苷，極性較大，提取溶劑主要為水、乙醇或兩者混合溶劑，提取方法主要為直接溶劑提取、超聲提取、微波提?。?］。韋文俊等［10］采用正交試驗(yàn)優(yōu)化羅漢果甜苷V 提取工藝，發(fā)現(xiàn)與50%乙醇回流提取比較，水煎煮法提取后其含有量較高；鄧福禮等［11］采用微波輔助濁點(diǎn)萃取法比較乙醇、甲醇、水、非離子表面活性劑GX-080 和TX-100 對(duì)羅漢果皂苷V 提取率的影響，發(fā)現(xiàn)該成分在乙醇中溶解度很低，含有量?jī)H為2.8 mg／g，在水中達(dá) 12 mg／g，而在 GX-080、TX-100 中更高，分別為 13.07、12.87 mg／g，故綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本、操作難易度等因素，本研究選擇水作為溶劑。結(jié)果表明，羅漢果中羅漢果皂苷最優(yōu)提取工藝為加15 倍量水浸泡30 min后提取3 次，每次60 min，該工藝穩(wěn)定可行，適合工業(yè)化生產(chǎn)，并且50 g／kg 提取物具有一定鎮(zhèn)咳祛痰作用。

近年來(lái)，羅漢果苷降血糖、降脂、抗氧化、抗炎等多種生理活性被不斷證實(shí)，在養(yǎng)生保健方面的研發(fā)中顯示出重要地位，目前已有一些產(chǎn)品上市［12-13］，但總體上數(shù)量還較少，尚有待進(jìn)一步探索。