戴 輝，蘇 杭，蔡鵬飛，殷放宙?，金 璇，李偉東，蔡寶昌

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性酸、甘、溫，歸肺、心、腎經(jīng)。具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之效。臨床用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠［1-2］。臨床常用的五味子炮制品為五味子及醋五味子。生五味子多入嗽藥，用于斂肺止咳止汗；醋蒸后增強(qiáng)酸澀收斂作用，澀精止瀉作用更強(qiáng)?，F(xiàn)代研究表明五味子以木脂素、有機(jī)酸、揮發(fā)油類等成分為主，其中木脂素成分為五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［3-6］。2015版 《中國藥典》 一部以五味子醇甲作為唯一指標(biāo)對五味子炮制品進(jìn)行質(zhì)量控制，文獻(xiàn)報(bào)道則集中在對五味子的木脂素成分含有量的分析［7］。實(shí)際上五味子生品為紅色果實(shí)，在炮制加工過程中，顏色會逐漸加深變黑，醋五味子炮制以顏色的變化作為重要的控制指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用分光測色儀量化了五味子炮制前后的顏色，并采用高效液相色譜法建立了五味子HPLC 指紋圖譜，同時測定了炮制前后8種代表性的木脂素的含有量，以期為五味子炮制品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

CM-5 型分光測色儀（日本柯尼卡美能達(dá)有限公司）；Waters 2695-2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli- Q3 超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；MS-105DU 型電子天平（美國Mettler Toledo 公司）；KQ-500E 型超聲儀（昆山市科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

五味子醇甲（批號Y13D8H50595）、五味子醇乙（批號 P28S6F3984）、五味子酯甲（批號P13O8F45575）、五味子酯乙（批號 P07M6S1）、五味子酚（批號P13O8F45574）、五味子甲素（批號 R12O8F45508 ）、五味子乙素（批號P29J8F38066）、五味子丙素（批號 P28J8F36961）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純（美國Tedia 公司）；甲醇為分析純（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

五味子樣品采自黑龍江、遼寧、吉林等地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)李偉東教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra Chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋五味子炮制 按照2015版 《中國藥典》一部，即取收集到的10 批凈五味子，照醋蒸法（通則0213）蒸至黑色。醋的用量為20%。

2.2 五味子炮制品顏色檢測 采用分光測色儀對五味子不同炮制品進(jìn)行顏色檢測，客觀量化生五味子（紅色），醋五味子（黑色）的顏色值。

2.2.1 顏色檢測條件 光源為脈沖氙燈，光源D65，標(biāo)準(zhǔn)觀察角度 8°，照明口徑 Φ3 mm，測量波長范圍為360～740 nm，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差ΔΕ?ab在0.07 以內(nèi)，采用SCE 反射光模式進(jìn)行測定。

2.2.2 供試品制備 每份樣品粉碎（過3 號篩），各取10 g 放入檢測皿中，重復(fù)測定色度3 次，以均數(shù)為最終測定結(jié)果。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 不同測色模式對測色結(jié)果影響考察 測色時具有SCI 與SCE 2種測量模式。SCI 測量模式下，鏡面反射光與漫反射光將同時測定，測出的值與觀測者肉眼觀察的物體顏色相當(dāng)；SCE 測量模式下，鏡面反射光被排除在外，只測定漫反射光，此與物體整體客觀顏色相當(dāng)，與物體表面條件無關(guān)。取同一批生五味子樣品粉碎后，分別測定其SCI 值與SCE 值并比較，結(jié)果表明，2種測量模式下，SCI 與SCE 測量值相近。因此本實(shí)驗(yàn)只針對 SCE模式測定的結(jié)果進(jìn)行分析［8］。

2.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一批次五味子樣品粉碎后進(jìn)行測色方法的相應(yīng)考察。連續(xù)采集同一份樣品的顏色 6 次，測得 L?、a?、b?的平均值分別為31.87、14.96、19.53，RSD分別為0.02%、0.03%、0.02%，表明該方法精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品分別于0、2、6、8、10、12、18、24、36、48 h 進(jìn)行顏色檢測，測得 L?、a?、b?的平均值分別為 31.87、14.96、19.53，RSD 分 別 為 0.03%、0.04%、0.06%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份樣品分別置于檢測皿中，進(jìn)行顏色檢測，測得 L?、a?、b?的平均值分 別 為 31.84、14.96、19.59，RSD 分 別 為1.05%、1.92%、1.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 樣品檢測 取10 批生五味子及對應(yīng)的醋五味子粉碎過3 號篩，各取10 g 放入檢測皿進(jìn)行顏色檢測，結(jié)果見表1。

2.3 五味子炮制品的指紋圖譜建立及木脂素類成分含有量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別配制成含 0.966 mg／mL 五味子醇甲、0.933 mg／mL 五味子醇乙、0.988 mg／mL 五味子酯甲、0.919 mg／mL 五味子酯乙、1.110 mg／mL 五味子甲素、1.008 mg／mL 五味子乙素、0.416 mg／mL五味子丙素以及0.454 mg／mL 五味子酚的對照品溶液。分別精密吸取各對照品母液適量至10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成含 386.4 μg／mL五味子醇甲、93.3 μg／mL 五味子醇乙、49.4 μg／mL五味子酯甲、45.95 μg／mL五味子酯乙、111.0 μg／mL五味子甲素、151.2 μg／mL 五味子乙素、20.8 μg／mL 五味子丙素以及 22.7 μg／mL 五味子酚的混合對照品溶液。

表1 各樣品顏色測定結(jié)果Tab.1 Color measurement results of various samples

2.3.2 供試品溶液制備 取五味子樣品粉末（過3 號篩）0.5 g，精密稱定，精密加入甲醇 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?50 W，頻率20 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，揮去部分溶劑，用甲醇定容至25 mL，過 0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3.3 色譜條件［9-10］Kromasil KR100-5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，2%～55% B；15～30 min，55%～60% B；30～50 min，60%～70% B；50～60 min，70%～100%B）；體積流量 1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。指紋圖譜分析檢測波長240 nm，參比波長380 nm，含有量測定檢測波長250 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品，注入高效液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 方法學(xué)考察

2.3.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取五味子供試品溶液，在 “2.3.3”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測得各待測化合物峰面積RSD 均≤1.42%，表明儀器精密度良好。

2.3.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取五味子供試品，在 “2.3.3”項(xiàng)色譜條件下分別于 0、3、8、13、18、24 h 進(jìn)樣，測得各待測化合物峰面積 RSD 均≤1.98%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取 6 份生五味子0.5 g，精密稱定，按 “2.3.2”下方法制備供試品溶液，在 “2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得各待測化合物的含有量RSD 均≤2.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批五味子粉末5 份，每份0.25 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入與樣品中含有量等量的對照品，按 “2.3.2”下方法制備供試品溶液，在 “2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的平均加樣回收率分別為100.81%、101.39%、100.07%、98.93%、100.49%、100.48%、101.19%、101.36%，RSD 分 別 為 1.03%、2.17%、2.22%、1.23%、2.48%、0.95%、1.06%、1.48%。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.6 指紋圖譜建立 將不同批次的生及醋五味子飲片各10 批樣品的液相色譜圖導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”［11-14］，見圖1，進(jìn)行色譜峰匹配，將232（個匹配色譜峰峰面積）×20（個／樣品）的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入 SIMCAP11 軟件，進(jìn)行 PCA 分析，見圖2。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

圖2 10 批樣品主成分分析圖Fig.2 PCA plot for ten batches of samples

2.3.7 樣品含有量測定 取各批五味子炮制品粉末（過 3 號篩）0.5 g，精密稱定，按 “2.3.2”下方法制備供試品溶液，在 “2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算含有量，每批樣品平行測定3 次。結(jié)果見圖3、表3。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分含有量測定結(jié)果（%）Tab.3 Results of content determination of various constituents（% ）

3 討論

CIEL?a?b?是國際照明委員會（CIE）于1976年推薦的均勻顏色模型，由于此模型充分符合人眼在紅綠方向上的視覺色差尺度均小于黃、藍(lán)方向的主觀特征［15-16］，因此 CIEL?a?b?顏色空間是目前涵蓋顏色范圍最廣的模式。此模型用L?、a?、b?3 個互相垂直的坐標(biāo)軸來表示1 個色彩空間，L?代表明度，黑在底端，白在頂端；a?軸的正方向代表紅色的變化，負(fù)方向代表綠色的變化；b?軸正方向代表黃色的變化，負(fù)方向代表藍(lán)色的變化。五味子在醋蒸后，顏色值 L?、a?、b?均發(fā)生了明顯的變化，其中尤以a?值與b?值變化最大，炮制后分別平均下降了61.55%、68.35%。炮制方法的描述主要依賴外觀性狀的變化來標(biāo)示中藥飲片的炮制程度，其中最主要是在加工過程中的顏色變化，所以應(yīng)當(dāng)考慮在飲片炮制過程中引入顏色變化的參數(shù)值來參與評判炮制程度，使其更加客觀［17-18］。

實(shí)驗(yàn)過程中，在優(yōu)化了樣品提取方法、次數(shù)及時間的基礎(chǔ)上建立了五味子的指紋圖譜，并進(jìn)行方法學(xué)考察。同時采用PCA 法對生、醋五味子樣品作了區(qū)分。數(shù)據(jù)PC1 與PC2 對方差的累積貢獻(xiàn)率＞82.3%，故提取前2 個主成分完全可表示樣品的主要信息。沿著PC1 方向，生五味子和醋五味子可得到較好的區(qū)分，生五味子的PC1 值小于醋五味子的PC1 值，表明五味子經(jīng)炮制后內(nèi)在成分發(fā)生了一定的變化。實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步采HPLC 法測定了五味子中代表性8種成分的含有量。結(jié)果表明各成分在炮制后均有一定程度的變化但無明顯差異。由此可知不可僅從木脂素成分的差異上去解釋五味子炮制后增加收斂作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。醋蒸樣品在色譜圖7.5 min 左右出現(xiàn)的明顯峰為5-羥甲基糠醛，由葡萄糖或果糖脫水生成，在炮制過程中易產(chǎn)生此類化合物。

實(shí)驗(yàn)中采用顏色評價、指紋圖譜及含有量測定對五味子炮制品進(jìn)行了分析評價，同時比較了醋蒸前后炮制品的差異。性狀與內(nèi)在成分相結(jié)合的方法可有效地實(shí)現(xiàn)對五味子炮制品的全面質(zhì)量分析。實(shí)驗(yàn)過程中選定的可較多體現(xiàn)樣品色譜信息的檢測波長為240 nm，而在此波長下較為集中地體現(xiàn)了五味子的活性成分木脂素類的信息，含有量測定亦是圍繞代表性的木脂素成分，由于木脂素成分較為穩(wěn)定，因此五味子醋蒸前后在指紋圖譜及含有量測定方面未見明顯差異，同時木脂素成分與五味子的顏色變化相關(guān)性不大。因此后期考慮采用HPLC-MS等技術(shù)手段更加全面地分析樣品成分信息，由此尋找五味子炮制前后成分差異及引起顏色變化的物質(zhì)基礎(chǔ)。