楊雁蕓，張艷麗，何玉環(huán)，白志堯，鄭曉珂，馮衛(wèi)生

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心 河南 鄭州 450046）

辛夷又名木筆花、毛辛夷，是木蘭科落葉喬木植 物 玉 蘭Magnolia denudataDesr.、望 春 花Magnolia biondiiPamp.或武當(dāng)玉蘭Magnolia sprengeriPamp.的干燥花蕾［1］，主產(chǎn)于河南、四川、湖北、浙江及安徽等地［2-3］。其性溫味辛，具有散風(fēng)寒、通鼻竅之功效，可用于治療鼻塞、鼻炎、風(fēng)寒頭痛等［4-6］。辛夷中含有木脂素、黃酮、萜類及生物堿等多種化學(xué)成分，木脂素是其主要的一類活性成分［2，7-8］。研究顯示，木脂素類化合物具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、血小板活化因子拮抗活性等多種藥理作用［9-11］。

2015版 《中國(guó)藥典》 對(duì)辛夷的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為含木蘭脂素不得少于 0.40%［1］，單一的化學(xué)成分難以全面保障和反映藥材的品質(zhì)及其有效性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定辛夷中12種木脂素類成分的含有量，以期為提升辛夷及其制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

ACQUITY 超高效液相色譜儀，配TQD 三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；AB135-S 型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士 Mettler Toledo 公司）；XK80-A 型快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；CENRIFUGE 5810R 離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf 公司）；SB-5200DTD 型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

對(duì)照品桉脂素（含有量98.36%）、木蘭脂素（含有量94.52%）、epimagnolin（含有量95.83%）、里立脂素B 二甲醚（含有量96.54%）、落葉松樹(shù)脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷（含有量90.83% ）、7R?，8S?-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside（DAG，含 有 量99.43% ）、4，4′-dimethoxy-3′-hydroxy-7，9′：7′，9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside（DHDG，含有量 90.72% ）、3′，4-O-dimethylcedrusin（含有量 98.88%）、松脂醇（含有量 90.99%）、fargesol（含有量95.26%）、辛夷脂素（含有量97.91%）、conicaoside（含有量92.87%），均由本實(shí)驗(yàn)室前期分離制備所得，1H，13C-NMR 和MS 數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道［12-20］一致，含有量經(jīng)高效液相色譜（面積歸一化法）檢測(cè)所得。甲醇、甲酸（均為色譜級(jí)，美國(guó)Fisher 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。4 批辛夷藥材購(gòu)于鄭州各大藥店，批號(hào)分別為 20140609、170501、170201、161206，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定均為望春花Magnolia biondiiPamp.的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取適量的各對(duì)照品，分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，搖勻即得各木脂素類成分的單一對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品溶液，加60% 甲醇水溶液，稀釋配制成含桉脂素 3 600 μg／mL、木蘭脂素1 030 μg／mL、epimagnolin 2 160 μg／mL、里立脂素B 二甲醚 1 940 μg／mL、落葉松樹(shù)脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖 苷 62.7 μg／mL、DAG 8.3 μg／mL、DHDG 20.6 μg／mL、3′，4-O-dimethylcedrusin 170 μg／mL、松脂醇 79.4 μg／mL、fargesol 570 μg／mL、辛夷脂素 530 μg／mL、conicaoside 14 μg／mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取辛夷藥材，分別打粉并過(guò)3 號(hào)篩后得藥材粉末。精密稱取0.5 g 藥材粉末，置入100 mL 具塞錐形瓶中，加入60%甲醇水溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率 40 kHz）提取 1 h，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量后用60% 甲醇水溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，12 000 r／min 離心 10 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取濾液即得。

2.2 色譜條件 Waters BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相 0.1% 甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～1 min，10%～40% B；1～3 min，40%～60% B；3～7 min，60%～100% B）；體積流量 0.2 mL／min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子切換掃描；毛細(xì)管電壓 3.5／2.5 kV；離子源溫度200 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣體積流量500 L／h；霧化器壓力3.0 V；檢測(cè)模式多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）。12種木脂素的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見(jiàn)表1，提取離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of various constituents

圖1 各成分離子流色譜圖Fig.1 Ion current chromatograms of various constituents

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 取混合對(duì)照品溶液，用60%甲醇水溶液逐級(jí)稀釋配制成6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，在 “2.2”和“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以各木脂素成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。信噪比S／N=3 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限，S／N=10 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。結(jié)果見(jiàn)表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取線性中間點(diǎn)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，在 “2.2”和 “2.3”項(xiàng)條件下，分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄12種木脂素成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤3.07%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份同一批次的辛夷藥材（批號(hào)170201），按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2”和 “2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算12種木脂素成分含有量的RSD≤3.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為170201 辛夷藥材的供試品試液，在 “2.2”和 “2.3”項(xiàng)條件下，于配制后 0、2、4、8、12 和 24 h 進(jìn)樣，測(cè)得各木脂素成分的峰面積，計(jì)算其RSD≤2.59%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取9 份已知各木脂素成分含有量的辛夷藥材粉末（批號(hào)170201），每份0.5 g，分別精密加入對(duì)照品貯備液，使加入量為樣品中各成分含有量的80%、100%、120%，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2”和 “2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定各成分含有量，計(jì)算加樣回收率，平均加樣回收率為 98.76%～102.32%，RSD 1.89%～2.58% 。

2.5 樣品含有量測(cè)定 取各批次廠家的辛夷藥材，按 “2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.2”和 “2.3”項(xiàng)條件下分析，計(jì)算各批次辛夷藥材中各成分的含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。采用 SPSS 19.0 軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行箱線圖分析，箱線圖是引入P值來(lái)評(píng)價(jià)不同批次間的差異（P=每個(gè)批次各化合物含有量／各批次各化合物的平均含有量×100%），P值越接近100% 表明批次間差異越小。結(jié)果見(jiàn)圖2，表明4 和12 2種成分批次間差異較大，其余成分P值均在75%至125%之間，差異波動(dòng)在可接受范圍內(nèi)。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

圖2 各成分箱線圖Fig.2 Box chart of various constituents

3 討論

在優(yōu)化提取條件時(shí)，本實(shí)驗(yàn)考察了不同溶劑（乙醇、甲醇、乙腈）、不同體積分?jǐn)?shù)（30%、60%、100%）以及不同提取時(shí)間（0.5、1、1.5 h），結(jié)果表明以60%甲醇水溶液超聲提取1 h，提取效率較高。

在優(yōu)化色譜條件時(shí)，通過(guò)改變流動(dòng)相（水、甲醇、乙腈）不同的組成比例，并添加不同電解質(zhì)（甲酸、乙酸、甲酸銨），發(fā)現(xiàn)以 0.1% 甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，峰形最佳，在7 min 內(nèi)可完成12種木脂素類成分的含有量測(cè)定。

辛夷中木蘭脂素的含有量遠(yuǎn)高于其他成分，桉脂素、epimagnolin、里立脂素 B 二甲醚、3′，4-O-dimethylcedrusin 和辛夷脂素的含有量較高，落葉松樹(shù)脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷、7R?，8S?-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside、4，4′-dimethoxy-3′-hydroxy-7，9′：7′，9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、松 脂 醇、fargesol 和conicaoside 的含有量較低。不同批次間12種成分的含有量具有一定波動(dòng)，分析與其藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間以及貯存條件等多種因素相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)建立的 UPLC-MS／MS 法可快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定辛夷中12種木脂素類成分的含有量，MRM 檢測(cè)模式與傳統(tǒng)的液相色譜相比，具有更高的選擇性和靈敏度，并且待測(cè)化合物無(wú)需完全分離即可進(jìn)行同時(shí)準(zhǔn)確定量。以期為提高辛夷藥材以及含辛夷中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，也為辛夷中木脂素類成分的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。