錢文丹，譚艾娟?，呂世明，陳波利，杜安定，王勝優(yōu)

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

天然抗腫瘤藥物作為抗腫瘤藥物中的1 個(gè)重要分支，必在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中具有重要的地位。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)五環(huán)三萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗 HIV 等藥理作用。樺木酸是 1種羽扇豆烷型的五環(huán)三萜，分布于樺木屬及其他許多屬植物中，是植物的次生代謝產(chǎn)物［1］。在研究中發(fā)現(xiàn)，樺木酸本身毒性較低，對(duì)正常細(xì)胞中的外周血淋巴細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞沒有毒性［2］，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡完成的［3］。課題組從中分離得到3 個(gè)化合物，化合物3 之前只在合成產(chǎn)物中所出現(xiàn)過，首次從杜仲中分離得到。選用HeLa 細(xì)胞為材料，與化合物1～2比較，著重對(duì)化合物3 的抗腫瘤活性機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 AVANCE Ⅲ 500 MHz NMR 超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國Brucker 公司）；UPLC-IT-TOF液相-離子阱飛行時(shí)間色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；Cellomics ArrayScan VTI HCS 高內(nèi)涵分析儀（美國 Thermo Scientific 公司）；FV1000 激光掃描共聚焦生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Lecia DM55008 熒光顯微鏡（德國 Lecia 公司）；Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；ECLIPSE Ts2R 倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Agilent 5973 N GCMS LC-MS／MS（美國 Agilent 公司）；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（美國 Thermo Scientific 公司）；XK96-Ⅰ微量振蕩器（上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水機(jī)（德國默克密理博公司）。超凈工作臺(tái)（美國 Thermo 公司）；MLS-3750 型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Sanyo 公司）。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 Hela 細(xì)胞株來源于中國科學(xué)院西南多樣性實(shí)驗(yàn)室、MDA-MB-231、T47D 細(xì)胞株來源于貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。杜仲購于云南省藥材市場(chǎng)。DMEM 培養(yǎng)液、Trypsin EDTA Solution A、FBS、Pen-Strep Solution 購自以色列 Biological Industries 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Amresco 公司）；Hoechst 33258、PI、DCFH-DA 試劑盒（美國 Sigma 公司）；Lysotracker Red DND 99、Mito-tracker Red CMXRos（美國 Invitrogen 公司）；正向?qū)游龉枘z（80～100 目，300～400 目），及制備型薄層層析硅膠GF254均為青島海洋化工生產(chǎn)；所用MCI gel CHP 20P 為日本三菱化工產(chǎn)品；凝膠色譜為 Sephadex LH-20（美國 GE Healthcare Bio-Xciences AB）；用5% H2SO4乙醇溶液作為常規(guī)顯色試劑等。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離 選取杜仲的二氯甲烷層經(jīng)100～200 目硅膠干法裝柱進(jìn)行劃段，分為10 個(gè)組分，并將第 2 個(gè)組分利用 Sephadex LH-20 洗脫，最后利用 300～400 目硅膠由純氯仿，氯仿 ∶丙酮（50 ∶1、30 ∶1、20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、3 ∶1）梯度洗脫得化合物1、3 的純品，以及化合物2 的粗提物，將化合物2 經(jīng)HPLC 分離，得到化合物2的純品。

1.2.2 MTT 法測(cè)定細(xì)胞毒活性 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Hela 細(xì)胞、MDA-MB-231 細(xì)胞、T47D 細(xì)胞，胰酶消化后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，并用含10% 胎牛血清的培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，以每孔6 000～10 000個(gè)細(xì)胞分別接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 L 細(xì)胞懸液，設(shè)置 4 個(gè)重復(fù)，放置于 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，加入待測(cè)化合物的DMSO 溶液（初篩濃度 40 μmol／L），將有抑制細(xì)胞活力的化合物設(shè)5 個(gè)濃度梯度進(jìn)行復(fù)篩，每種濃度處理均設(shè)4 個(gè)復(fù)孔作為重復(fù)對(duì)照，順鉑做為陽性藥物，并設(shè)置陽性、陰性和空白對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，除空白對(duì)照組每孔加 MTT（5 mg／mL）溶液100 L，繼續(xù)孵育 4 h，每孔加 100 L 的 DMSO 溶液，振蕩 5～15 min。選擇以 570 nm 為波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀取各孔光吸收值，利用公式計(jì)算化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的抑制［4］?；罴?xì)胞率=（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）／細(xì)胞總數(shù)×100%。采用 GraphPad Prism 5.0 軟件計(jì)算化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值。

1.2.3 PI，Hoechst 染色測(cè)定細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela 細(xì)胞計(jì)數(shù)并配成細(xì)胞懸液，選取12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔放入蓋玻片，將Hela 細(xì)胞接種于蓋玻片上（為了在正置熒光顯微鏡下拍照方便），待細(xì)胞長(zhǎng)到20%，加不同濃度的化合物處理48 h 后用 PBS 洗滌細(xì)胞并用 4% 多聚甲醛固定20 min，用 PBS 洗滌之后加Hoechst 33342（10 μg／mL）和 PI（10 μg／mL）放于細(xì)胞培養(yǎng)箱染色30 min，并放于正置熒光顯微鏡下，選紅色和藍(lán)色通道的熒光進(jìn)行拍攝分析。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)源ROS 測(cè)定 待培養(yǎng)皿細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞。并將細(xì)胞接種于準(zhǔn)備好的12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置過夜待細(xì)胞貼壁，加入化合物處理24 h（提前1 h 加入陽性對(duì)照ROS 活性氧供氫體），每孔加入 DCFH-DA 探針后放于培養(yǎng)箱25～30 min，正置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5 Mito-tracker 染料測(cè)定細(xì)胞線粒體形態(tài) 用激光共聚焦小皿鋪HeLa 細(xì)胞，藥物處理24 h 后，以 Mito-tracker 熒光探針按5 000 ∶1 的濃度稀釋并對(duì)細(xì)胞著色，染完線粒體時(shí)需換新鮮培養(yǎng)基讓細(xì)胞反吐30 min，并用4%甲醛固定15 min，隨后將甲醛吸掉，加入PBS，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)的變化［5］。

1.2.6 lysotracker 篩選化合物抑制溶酶體酸化和誘導(dǎo)溶酶體生成 在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞懸液每孔100 μL，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右，且在細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下，加入溶解于 DMSO 的化合物至終濃度為 40 μmol／L，放置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3～4 h，隨后加入Lysotracker Red DND 99 繼續(xù)孵育30 min 后利用高內(nèi)涵藥物篩選儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度，并將有效果的化合物進(jìn)行復(fù)篩［6］。將HeLa 細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)并加入激光共聚焦小皿，每個(gè)小皿加2 mL 細(xì)胞懸液，待細(xì)胞密度至 70%～80%，加藥處理 3～4 h 后，染色30 min。去除含有 Lysotracker Red DND 99 的培養(yǎng)液，添加新的培養(yǎng)液，并在倒置熒光顯微鏡下，以488 nm為波長(zhǎng)進(jìn)行拍照，從而觀測(cè)熒光強(qiáng)度是否增強(qiáng)或減弱［7］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0 生成柱狀圖，計(jì)算IC50值。所有數(shù)據(jù)均以（）表示，采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用單因素方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05 差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT顯示該化合物有30 個(gè)碳信號(hào)，分別為6 個(gè)甲基，11 個(gè)亞甲基，6 個(gè)次甲基和 7 個(gè)季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：4.95（1H，brs，Hβ-29），4.77（1H，brs，Hα-29），3.50（1H，dd，J=15.9，7.4 Hz，H-3），2.25（1H，m，H-19），1.79，0.99，0.97，0.96，0.88，0.85（Me-30，Me-27，Me-23，Me-26，Me-25，Me-24），0.67（1H，d，J=8.7 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：C：39.5（C-1），28.7（C-2），78.1（C-3），39.3（C-4），55.9（C-5），18.8（C-6），34.8（C-7），41.1（C-8），51.0（C-9），37.5（C-10），21.2（C-11），26.1（C-12），38.6（C-13），42.9（C-14），31.2（C-15），32.9（C-16），56.7（C-17），47.8（C-18），49.8（C-19），151.4（C-20），30.3（C-21），37.5（C-22），28.3（C-23），14.9（C-24），16.4（C-25），16.4（C-26），14.9（C-27），178.9（C-28），110.0（C-29），19.5（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致，故鑒定為樺木酸。

化合物2：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT顯示該化合物有30 個(gè)碳信號(hào)，分別為7 個(gè)甲基，11 個(gè)亞甲基，6 個(gè)次甲基和 6 個(gè)季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：4.88（1H，brs，Hβ-29），4.74（1H，brs，Hα-29），3.34（1H，m，H-3），2.15（1H，m，H-19），1.77（3H，s，Me-30），1.03，0.99，0.97，0.85，0.80，0.79（Me-26，Me-27，Me-23，Me-25，Me-28，Me-24），0.69（1H，d，J=10.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：C：37.6（C-1），27.6（C-2），78.2（C-3），39.6（C-4），55.9（C-5），18.8（C-6）34.7（C-7），41.3（C-8），50.8（C-9），37.4（C-10），19.3（C-11），25.8（C-12），37.5（C-13），43.0（C-14），27.6（C-15），34.9（C-16），43.0（C-17），48.4（C-18），48.6（C-19），150.1（C-20），30.1（C-21），39.6（C-22），28.3（C-23），16.2（C-24），16.4（C-25），16.5（C-26），15.0（C-27），18.8（C-28），110.0（C-29），19.3（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致，故鑒定為羽扇豆醇。

化合物3：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT顯示該化合物有41 個(gè)碳信號(hào)，分別為7 個(gè)甲基，20 個(gè)亞甲基，6 個(gè)次甲基和 8 個(gè)季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：0.84（3H，m，H-11′），0.87（3H，Me-24），0.96（3H，Me-23），1.22（9H，Me-25，Me-26，Me-27），1.27（6H，H-5′，H-6′，H-7′），1.34（6H，H-4′，H-8′，H-9′），1.37（2H，H-10′），1.42（1H，m，H-5），1.64（2H，H-3′），2.21（1H，m，H-19），2.35（2H，H-2′），4.41（1H，dd，J=12.4 Hz，H-3），4.58（1H，brs，Hα-29），4.72（1H，brs，Hβ-29）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：14.3（C-11′），14.9（C-27），16.4（C-24），16.4（C-25），18.8（C-26），18.2（C-6），19.5（C-30），21.2（C-11），22.7（C-10′），24.7（C-12），25.4（C-8′），25.7（C-2），28.7（C-23），29.0（C-4′），29.3（C-5′），29.6（C-6′），29.6（C-7′），30.3（C-21），29.9（C-15），25.0（C-3′），31.9（C-9′），32.0（C-16），34.2（C-2′），35.2（C-7），37.1（C-22），37.5（C-10），37.7（C-4），38.6（C-13），38.6（C-1），40.7（C-8），42.5（C-14），49.3（C-18），48.0（C-19），50.6（C-9），55.5（C-5），56.8（C-17），80.9（C-3），110（C-29），150.3（C-20），173.1（C-1′），181.2（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］基本一致，故鑒定為3-O-laurylbetulinic acid。

2.2 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力 將化合物 1、3 對(duì)HeLa 細(xì)胞按不同濃度（3.75～60 μmol／L）處理72 h，化合物 2 對(duì) HeLa 細(xì)胞按不同濃度（5～80 μmol／L）處理 48 h，見圖1，表明隨著加藥濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低。每一組加藥處理組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?；衔?1、3 濃度為 60 μmol／L 時(shí)，對(duì) Hela 細(xì)胞增殖抑制率分別為 75%、80%；化合物 2 濃度為80 μmol／L 時(shí)，抑制率達(dá) 86% ，表明化合物 1～3對(duì)Hela 細(xì)胞有細(xì)胞毒活性，且與加藥濃度呈正相關(guān)。將化合物 1～3 對(duì) MDA-MB-231、化合物 3 對(duì)T47D 細(xì)胞按 5～80 μmol／L 的濃度梯度處理 48 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力按梯度不斷下降，表明化合物1～3對(duì)這2 株乳腺癌細(xì)胞均有細(xì)胞毒活性。由柱狀圖可以看出當(dāng)這3 個(gè)化合物濃度降低至很低時(shí)，仍對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力起抑制作用。然而隨著濃度的增高，藥效的增幅卻不十分明顯?；衔?～3 對(duì)3株腫瘤細(xì)胞的IC50見表1。

圖1 各化合物對(duì)Hela、MDA-MB-231、T47D 細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of various compounds on the cell viability of Hela，MDA-MB-231 and T47D cells

表1 抗腫瘤實(shí)驗(yàn) IC50值（μmol·L-1）Tab.1 IC50 values in antitumor tests（μmol·L-1）

2.3 PI 和 Hoechst 染色 將化合物 1、3 以 30、60 μmol／L的濃度，化合物 2 以 40、80 μmol／L 的濃度處理 HeLa 細(xì)胞 48 h，并用 Hoechst 染色。發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且淡藍(lán)色細(xì)胞減少，亮藍(lán)色細(xì)胞增多；并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的畸形變化，一些細(xì)胞核呈月牙型且邊集化，表明細(xì)胞正在啟動(dòng)凋亡。用PI 染色后，發(fā)現(xiàn)隨著濃度加大和時(shí)間延長(zhǎng)，紅色熒光逐漸增強(qiáng)，表明細(xì)胞膜破損的死細(xì)胞增加。當(dāng)化合物1、3 的濃度達(dá)到30 μmol／L 時(shí)，細(xì)胞就開始出現(xiàn)明顯凋亡的現(xiàn)象。化合物 2 在濃度達(dá)到 80 μmol／L 時(shí)，同樣出現(xiàn)了明顯的凋亡跡象。表明這3 個(gè)化合物都能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖2。

2.4 DCFH-DA 探針測(cè)定 Hela 細(xì)胞中 ROS 的生成 由于ROS 的產(chǎn)生是細(xì)胞凋亡的早期事件，因此在化合物3 處理24 h 后測(cè)定細(xì)胞中的ROS。見圖3，隨著化合物3 濃度的增加，綠色熒光增強(qiáng)。與陰性對(duì)照組相比，H2O2組及 40 μmol／L 的化合物3 誘導(dǎo)明亮的綠色熒光，表明有大量的ROS 產(chǎn)生，而對(duì)照組的ROS 處于基礎(chǔ)水平。結(jié)果表明，由于ROS 的過量生成，化合物3 誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.5 lysotracker 和Mito-tracker 染料測(cè)定溶酶體和線粒體形態(tài) 將 HeLa 細(xì)胞以 40 μmol／L 的化合物1～3 處理 4 h 后，用 Lysotracker Red DND 99 染料染色0.5 h，并用高內(nèi)涵藥物篩選儀分析并計(jì)算出細(xì)胞密度以及熒光強(qiáng)度?；衔?～2 處理組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），化合物3 處理組與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），通過平均熒光強(qiáng)度的比較，初步判斷，這3 個(gè)化合物能抑制溶酶體的酸化，且化合物3 的抑制效果相對(duì)較明顯。初步篩選完后，利用激光共聚焦掃描顯微鏡或倒置熒光顯微鏡具體觀察，可發(fā)現(xiàn)，加藥組的熒光強(qiáng)度相比對(duì)照組明顯降低。由此可判斷這類化合物能抑制溶酶體的生成，且化合物3 的抑制效果相對(duì)化合物1～2 更明顯，原因可能是化合物3 相比化合物1～2，空間位阻要更大一些。見圖4。

圖2 各化合物對(duì)HeLa 細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of various compounds on apoptosis of HeLa cells

圖3 熒光探針DCF-DA 評(píng)估Hela 細(xì)胞中ROS 產(chǎn)生Fig.3 Evaluation of ROS generation in Hela cells by the fluorescent probe DCF-DA

圖4 Lysotracker 著色后平均熒光強(qiáng)度Fig.4 Average fluorescence intensity of cells stained with Lysotracker

將 HeLa 細(xì)胞以 40 μmol／L 化合物 1～3 處理24 h后，用 Mito-tracker Red 染料染色?？砂l(fā)現(xiàn)加藥處理后的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，正常細(xì)胞線粒體呈絲狀或者絮狀，而化合物處理組線粒體呈顆粒狀，其中化合物2～3 較為明顯，由此可推斷這一類化合物能誘導(dǎo)線粒體形態(tài)發(fā)生變化。見圖5。

3 討論

圖5 Mito-tracker 探針對(duì)HeLa 細(xì)胞線粒體的熒光標(biāo)記Fig.5 Fluorescent labeling of mitochondria in HeLa cells by Mito-tracker probe

天然小分子化合物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)展的前期基礎(chǔ)研究［10］。近年來，隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)、藥理學(xué)研究的深入，天然抗腫瘤藥物逐漸引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞凋亡的方式主要包括線粒體依賴的凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)凋亡、DNA 損傷及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的凋亡［11］。最新的研究也表明惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及穩(wěn)態(tài)調(diào)控與細(xì)胞自噬及溶酶體的調(diào)控和功能密切相關(guān)［12］，這也是未來研究腫瘤治療的熱點(diǎn)和新方向。溶酶體是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)降解底物的細(xì)胞器，也是信號(hào)傳導(dǎo)的重要樞紐［13］。溶酶體功能的缺失會(huì)導(dǎo)致諸如溶酶體貯積癥（LSD）和帕金森病等重大疾?。?4］。在動(dòng)物細(xì)胞中，溶酶體被認(rèn)為是內(nèi)吞途徑的終端消化細(xì)胞器，富含大量的酸性水解酶，溶酶體膜蛋白多為糖蛋白，其膜內(nèi)表面帶負(fù)電荷，這對(duì)防止細(xì)胞自身被消化有重要的意義［15］。

目前靶向治療藥物阿法替尼等在臨床上應(yīng)用廣泛［16］，具有特異性強(qiáng)、療效顯著、對(duì)正常組織損傷小等優(yōu)勢(shì)，但是長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用和耐藥性，因而人們迫切需要開發(fā)機(jī)制新穎、作用更強(qiáng)、安全性更高的抗腫瘤藥。據(jù)報(bào)道，樺木酸類化合物誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制很多，可能直接作用于線粒體而觸發(fā)凋亡。樺木酸在細(xì)胞游離系統(tǒng)中，經(jīng)誘導(dǎo)通透性轉(zhuǎn)變的線粒體，能通過釋放可溶性因子等方式介導(dǎo)caspase-8 和caspase-3 的分裂。文獻(xiàn)中2，3 -羥基樺木酸在體外能使黑色素瘤細(xì)胞阻滯在某一生長(zhǎng)期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。羽扇豆醇酯能夠體外誘導(dǎo)TE-1 細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，其作用機(jī)理與下調(diào)CyclinD1 和CDK4 的蛋白表達(dá)，上調(diào)抑癌基因p53 的表達(dá)有關(guān)。也能有效地抑制人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是抑制了核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 信號(hào)途徑［18］。本實(shí)驗(yàn)以樺木酸及其類似物為研究對(duì)象，尋求具有高強(qiáng)度抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物結(jié)構(gòu)類型。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從杜仲二氯甲烷提取物中分離得3 個(gè)化合物，并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)均有良好的抗腫瘤活性，經(jīng) MTT 法測(cè)定其對(duì) HeLa、MDAMB-231、T47D 細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制。又將這 3 個(gè)化合物分別進(jìn)行PI 和Hoechst 染色，發(fā)現(xiàn)化合物1、3 達(dá)到 30 μmol／L 時(shí)，均能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而化合物2 的活性相對(duì)較弱一些。化合物3 能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源 ROS 的生成，最后將這3 個(gè)化合物分別處理的腫瘤細(xì)胞利用Lysotracker Red DND 99 熒光探針染色，這3 個(gè)化合物均能抑制溶酶體的生成，其中化合物3 的抑制效果相對(duì)較明顯。用Mito-tracker Red 熒光探針標(biāo)記線粒體，發(fā)現(xiàn)這些化合物能促使線粒體形態(tài)破碎。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，推斷這類化合物的抗腫瘤作用可能是溶酶體和線粒體依賴的相關(guān)途徑。