馬燕花，邱曉青，師 霞，余臣祖

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020）

非酒精性脂肪性肝病是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌［1-2］，該疾病由于可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病，一直備重視。研究表明，非酒精性脂肪性肝病小鼠有明顯的胰島素抵抗［3］，其所致肝細(xì)胞內(nèi)甘油三脂蓄積被認(rèn)為是重要致病因素。胰島素受體底物-1（IRS-1）是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要因子，在胰島素抵抗中起到重要作用［4］。

腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）存在對(duì)立、統(tǒng)一的2 條軸：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）-血管緊張素Ⅱ（1-8）［AngⅡ（1-8）］-血管緊張素Ⅱ 1 型受體（AT1）軸、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2（ACE2）-血管緊張素（1-7）［Ang-（1-7）］-［Ang-（1-7）］受體（MAS）軸［5］。研究表明［6-8］，AngⅡ參與并促進(jìn)胰島素抵抗發(fā)生，而 ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸作為RAS 的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)軸，對(duì)胰島素抵抗的發(fā)生有抑制作用［9］。本實(shí)驗(yàn)用黃芪多糖對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)ACE2-Ang-（1-7）-Mas 軸及胰島素抵抗的影響，進(jìn)一步闡明該成分的分子生物學(xué)機(jī)制，為相關(guān)臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 40 只，體質(zhì)量180～220 g，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，許可證號(hào) SCXK（甘）2015-0001，動(dòng)物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度（22±2）℃左右，相對(duì)濕度 50%～60%左右，12 h 光照維持，晝夜循環(huán)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由攝食飲水，普通飼料喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理規(guī)定，并通過(guò)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥 黃芪多糖購(gòu)自南京澤朗生物科技有限公司，含有量90.11%。鹽酸吡格列酮由北京太洋藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格 15 mg，7 片／盒，批號(hào)161101，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。高脂飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供（普通飼料＋15% 豬板油＋1% 膽固醇＋10% 蛋黃粉＋0.2% 膽酸鈉），真空包裝成10 kg／袋。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào) 13352801）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào) 14640501）、總膽固醇（TC，批號(hào)13585401）、甘油三酯（TG，批號(hào) 14854801）試劑盒均購(gòu)自德國(guó)羅氏公司；MDA（批號(hào) s0131）、SOD（批號(hào)s0101）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ang1-7 ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)RA036）購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司；DEPC（批號(hào) E174）購(gòu)自美國(guó) Amresco 公司；Trizol（批號(hào)9109）、qPCR 反應(yīng)試劑盒（批號(hào) RR420 A）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)RR047 A）購(gòu)自日本TakaRa 公司；ECL 發(fā)光液、PVDF 膜購(gòu)自美國(guó) Millopore 公司；羊抗IgG 抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ACE2（批號(hào) ab108252）、IRS-1（批號(hào) ab131487）、MAS（批號(hào) ab200685）一抗均購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；β-actin 購(gòu)自美國(guó) CST 公司。

1.3 儀器 iMark 酶標(biāo)儀、Western blot 轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）；Mx3005P 實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó) Agilent 公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 高脂飼料建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。大鼠常規(guī)喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為正常組［普通標(biāo)準(zhǔn)飼料（總熱量15.335 J／g，碳水化合物占53%，脂肪占 9%，蛋白質(zhì)占 20%）］、造模組（高脂飼料），第12 周末隨機(jī)處死造模組大鼠2 只，取出肝臟作病理切片，發(fā)現(xiàn)模型建立成功。將造模成功大鼠（30 只）隨機(jī)分為模型組、黃芪多糖組、吡格列酮組［10］，每組 10 只，灌胃給藥，其中黃芪多糖組［11-12］劑量為 400 mg／kg 灌胃，吡格列酮組劑量為 20 mg／kg，正常組、模型組為等容量生理鹽水，灌胃體積1 mL／100 g，各組大鼠飲食不變，連續(xù)給藥 4 周，1 次／d，觀察大鼠進(jìn)食、飲水、行為、活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)、大小便等情況，每1 周記錄動(dòng)物體質(zhì)量1 次，持續(xù)至16周。然后，大鼠禁食 24 h，次日腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血，3 000 r／min 離心15 min，分離血清，-20 ℃下保存，迅速取出肝臟，稱定肝濕重，-80 ℃下冷凍保存。

2.2 肝指數(shù)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱定大鼠體質(zhì)量和肝濕重，肝指數(shù)=（肝濕重／體質(zhì)量）×100%。

2.3 血清肝功能、血脂指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè) ALT、AST、TG、TC 水平，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD 水平，硫代巴比妥酸法檢測(cè) MAD水平。

2.4 血清 Ang（1-7）水平檢測(cè) 取待測(cè)血清50 μL，加入 ELISA 試劑盒檢測(cè)孔中，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A），結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)血清 Ang（1-7）水平。

2.5 肝臟組織病理學(xué)變化觀察 取部分大鼠肝組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備組織石蠟切片，HE 染色，光鏡下進(jìn)行觀察。

2.6ACE2、Mas、IRS-1 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR 法。取 100 mg 左右大鼠肝組織，Trizol 法提取總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品質(zhì)量濃度（ng／μL），測(cè)得A260nm／A280nm比值在1.8～2.1 之間，提示 RNA 質(zhì)量較好，取 1 μg RNA 樣品用于合成cDNA。按照RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書操作步驟對(duì)ACE2、Mas、IRS-1 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，三者 mRNA 檢測(cè)所需引物均根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR 引物設(shè)計(jì)原則，由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成（表1）。采用兩步法 PCR 反應(yīng)程序（體積 25 μL），第一步95 ℃ 30 s；第二步 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，44 個(gè)循環(huán)，靶基因相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。取20 mg 左右冷凍的大鼠肝臟組織樣本，剪碎，加入RIPA 組織裂解液提取各組肝組織總蛋白，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取 40 μg 蛋白，10%SDS-PAGE 分離后電轉(zhuǎn)運(yùn)至PVDF 膜上，置于2%酪蛋白溶液中，室溫下振搖 1.5 h，加入兔抗鼠 ACE2、兔抗鼠 Mas，兔抗鼠 β-actin 單抗（1 ∶1 000 稀釋），4 ℃ 下孵育過(guò)夜；TBST 洗膜 3 次，加入二抗室溫孵育 1 h，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（1 ∶2 000 稀釋），再洗膜3 次，加入 ECL 發(fā)光液壓片顯影，掃描攝取圖像。然后，用Quantity one 軟件分析條帶的灰度值，以 ACE2、Mas、IRS-1 與 β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 19.0 進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝指數(shù) 表2顯示，與正常組比較，模型組肝指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組肝指數(shù)均顯著下降（P＜0.01）。

表2 黃芪多糖對(duì)肝指數(shù)的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Astragali Radix polysaccharides on liver indices（， n=10）

表2 黃芪多糖對(duì)肝指數(shù)的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Astragali Radix polysaccharides on liver indices（， n=10）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別 體質(zhì)量／g 肝濕重／g 肝指數(shù)／%正常組 287.63±75.82 10.43±2.70 3.64±0.18模型組 272.20±71.42 11.53±2.89 4.29±0.41#黃芪多糖組 296.20±66.57 6.87±0.97 2.36±0.23▲▲吡格列酮組 303.90±88.71 7.50±1.92 2.50±0.20▲▲

3.2 血清指標(biāo) 表3顯示，與正常組比較，模型組 ALT、AST、TC、TG、MDA、Ang1-7 水平顯著升高（P＜0.05），SOD 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪多糖組 ALT、AST、TC、TG、MDA 水平顯著降低（P＜0.01），Ang1-7、SOD 水平顯著升高（P＜0.01）。

3.3 肝臟組織病理學(xué)變化 圖1顯示，正常組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索、肝竇分布正常，肝細(xì)胞形態(tài)一致，未見(jiàn)明顯變性壞死，小葉內(nèi)及匯管區(qū)未見(jiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索明顯增寬，肝竇融合，可見(jiàn)肝細(xì)胞彌漫性脂肪變，部分區(qū)域匯管區(qū)及小葉內(nèi)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，黃芪多糖組、吡格列酮組大鼠肝組織脂肪變及炎癥反應(yīng)明顯減輕，僅少數(shù)區(qū)域肝細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)極少量大小不等脂肪空泡，匯管區(qū)及小葉內(nèi)未見(jiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.4ACE2、Mas、IRS-1 mRNA 表達(dá) 表4顯示，與正常組比較，模型組ACE2、MasmRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01），IRS-1 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組三者mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。

表3 黃芪多糖對(duì)血清指標(biāo)的影響（， n=10）Tab.3 Effects of Astragali Radix polysaccharides on serum indices（， n=10）

表3 黃芪多糖對(duì)血清指標(biāo)的影響（， n=10）Tab.3 Effects of Astragali Radix polysaccharides on serum indices（， n=10）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別 ALT／（U·L-1）AST／（U·L-1）TC／（mmol·L-1）TG／（mmol·L-1 ）SOD／（U·mL-1）MDA／（μmol·L-1）Ang1-7／（ng·L-1）正常組 32.40±2.67 120.80±13.61 1.53±0.27 0.63±0.13 423.76±22.46 11.91±1.54 0.08±0.01模型組 44.35±10.53# 182.60±70.16# 1.89±0.22# 1.07±0.29## 131.00±11.22## 30.96±1.19## 0.35±0.04##黃芪多糖組 27.91±8.04▲▲ 115.10±19.33▲▲ 1.46±0.16▲▲ 0.34±0.09▲▲ 328.84±34.45▲▲ 17.55±2.67▲▲ 1.30±0.14▲▲吡格列酮組 26.33±7.46▲▲ 96.55±52.71▲▲ 1.46±0.31▲▲ 0.48±0.08▲▲ 395.89±39.53▲▲ 16.32±1.51▲▲ 1.17±0.07▲▲

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（HE，×40）Fig.1 Liver histopathological changes of rats in various groups（HE，×40）

表4 黃芪多糖對(duì) ACE2、 Mas、 IRS-1 mRNA 表達(dá)的影響（， n=10）Tab.4 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2， Mas and IRS-1 mRNA expressions（，n=10）

表4 黃芪多糖對(duì) ACE2、 Mas、 IRS-1 mRNA 表達(dá)的影響（， n=10）Tab.4 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2， Mas and IRS-1 mRNA expressions（，n=10）

注：與正常組比較，# P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別 ACE2 Mas IRS-1正常組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 2.51±0.47## 2.60±0.23## 0.6071±0.004#黃芪多糖組 3.97±0.36▲▲ 6.12±0.43▲▲ 6.115±0.155▲▲吡格列酮組 7.96±0.54▲▲ 6.38±0.49▲▲ 1.349±0.00848▲▲

3.5 ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達(dá) 表5、圖2顯示，與正常組比較，模型組 Mas、ACE2 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），IRS-1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組三者蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生與胰島素抵抗密切相關(guān)，被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)［13］，胰島素的代謝功能主要通過(guò)磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3k）信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)，它通過(guò)與胰島素受體結(jié)合來(lái)使后者底物蛋白（IRS）磷酸化，進(jìn)一步激活PI3k，并導(dǎo)致蛋白激酶B（Akt／PKB）磷酸化而發(fā)揮胰島素生物學(xué)效應(yīng)［14］。IRS 是 1種具有胰島素受體蛋白酪氨酸激酶活性的、結(jié)構(gòu)相似的信號(hào)蛋白，主要包括IRS-1、IRS-2，其中前者表達(dá)于肝臟、骨骼肌等組織，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要因子，在胰島素抵抗中起著重要作用［15］。

表5 黃芪多糖對(duì)ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達(dá)的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2，Mas and IRS-1 protein expressions（，n=10）

表5 黃芪多糖對(duì)ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達(dá)的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2，Mas and IRS-1 protein expressions（，n=10）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 ACE2 Mas IRS-1正常組 0.68±0.09 0.80±0.01 0.97±0.06模型組 1.30±0.28## 0.94±0.09# 0.84±0.03#黃芪多糖組 1.68±0.12▲ 1.09±0.07▲ 0.96±0.03▲吡格列酮組 1.77±0.23▲ 1.42±0.03▲▲ 1.04±0.10▲▲

ACE2 是 2000年由 Donoghue［16］、Tipnis［17］研究小組發(fā)現(xiàn)的RAS 家族新成員，其主要生物學(xué)作用是水解AngⅠ、AngⅡ，從而產(chǎn)生降解產(chǎn)物Ang-（1-7），它主要分布在血管、心臟、腎臟、肝臟，與其特異性受體MAS 結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，Mas受體由Mas 原癌基因編碼，屬于7 次跨膜的G 蛋白偶聯(lián)受體，表達(dá)于人類及大鼠心臟、腎臟、肝臟、脂肪組織、睪丸、骨骼肌、視網(wǎng)膜色素上皮等部位，正常肝臟中 ACE2-Ang-（l-7）-Mas、ACEAngⅡ-AT1R 系統(tǒng)均有表達(dá)［18］，而當(dāng)肝臟損傷時(shí)兩者均表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)。研究表明，非酒精性脂肪性肝炎大鼠經(jīng)AngⅡ處理后胰島素抵抗程度明顯加重，而敲除AT-1 受體或給予ARB 預(yù)處理后明顯減輕［19］，AngⅡ可通過(guò)促進(jìn)胰島素受體絲氨酸磷酸化，抑制IRS-1 酪氨酸磷酸化，從而降低胰島素敏感性［20］；ACE2-Ang（1-7）-Mas 系統(tǒng) 通 過(guò) 促使IRS-1 磷酸化來(lái)激活 PI3k 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低血脂、改善胰島素抵抗［21-22］。研究表明，Ang-（1-7）轉(zhuǎn)基因大鼠血脂水平明顯降低，胰島素敏感性增強(qiáng)［23］，而且Mas 基因敲除小鼠出現(xiàn)血脂水平升高、胰島素抵抗［24-25］。

圖2 各組 Mas（a）、ACE2（b）、IRS-1（c）蛋白表達(dá)Fig.2 Mas（a），ACE2（b）and IRS-1（c）protein expressions in various groups

黃芪作為傳統(tǒng)中藥材，具有扶正補(bǔ)氣之功效，黃芪多糖是其重要的天然有效成分，具有 扶正固本、補(bǔ)中益氣、化痰祛脂功效［26］，可降低血脂，增加胰島素敏感性［27］，但其具體降脂護(hù)肝機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)用黃芪多糖對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠進(jìn)行治療，觀察其對(duì) ACE2-Ang-（l-7）-Mas系統(tǒng)及IRS-1 表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)模型大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂、Ang-（l-7）水平明顯升高，肝組織ACE2、Mas 表達(dá)明顯增加，IRS-1 表達(dá)明顯減低，而黃芪多糖干預(yù)后大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂明顯降低，Ang-（l-7）水平及 ACE2、Mas、IRS-1 表達(dá)模型提高，病理學(xué)檢查顯示，肝組織脂肪變性明顯減輕。由此可知，黃芪多糖能顯著改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰島素抵抗，具有很好的降脂、保肝作用，其機(jī)制可能與上調(diào) ACE2、Mas、Ang-（l-7）水平，進(jìn)而促進(jìn)IRS-1 磷酸化有關(guān)。