薛 梅楊 琳宋 磊李長坤楊 斌繆 宇馬 燕史大卓

阿司匹林(aspirin，ASA)是心血管血栓性疾病抗血小板治療的基石[1]。然而，ASA導(dǎo)致的胃腸道損傷[2]和阿司匹林抵抗[3]現(xiàn)象影響了ASA的臨床療效、安全性和病人的服藥依從性。如何增強ASA抗血小板作用、減輕胃腸道損傷，是心血管領(lǐng)域關(guān)注的焦點。ASA不可逆抑制環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)，影響花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝通路下游各因子的表達(dá)，通過減少血小板血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)合成發(fā)揮抗血小板作用[4]，但因為同時抑制了胃黏膜前列環(huán)素(prostaglandins，PGs)合成[5]，導(dǎo)致胃黏膜損傷、出血。課題組前期研究表明，三七總皂苷(panax notoginseng saponin，PNS)具有抗血小板黏附和聚集的作用，并可減輕ASA聯(lián)合氯吡格雷誘導(dǎo)的胃黏膜損傷[6-7]。最新研究顯示，AA通路下游的多種脂質(zhì)代謝物在血小板活化與抑制[8]、胃黏膜損傷與修復(fù)方面扮演重要角色[9-11]。AA代謝通路調(diào)控是否為PNS抗血小板及保護(hù)胃黏膜的潛在機制尚缺少研究。本研究通過建立大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型，觀察PNS保護(hù)AMI大鼠胃黏膜和增強阿司匹林抗血小板的作用，并基于共同存在血小板及胃黏膜細(xì)胞的AA通路探討其作用機制，為PNS聯(lián)合阿司匹林的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠(體重200～250 g)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物合格證號：SCXK(京2016-0006)。

1.2 實驗藥物 三七總皂苷[血塞通軟膠囊(理洫王)]，每粒0.33 g，每粒含三七總皂苷60 mg，批號：國藥準(zhǔn)字Z19990022。阿司匹林腸溶片，每片100 mg，批號：國A20070002。

1.3 試劑和儀器 氯化三苯四唑(2，3，4-triphenyltetrazolium，TTC)、改良臺式液、葡萄糖、一水檸檬酸、二水檸檬酸三鈉，購自北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，購自Chrono-log公司；COX-1熒光活性試劑盒，Cayman chemical公司生產(chǎn)；COX-1抗體，Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品購自CSW公司。乙腈、甲酸、甲醇、乙醇(色譜純)，購自Sigma Aldrich公司。C8色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.6)，Phenomenex公司生產(chǎn)。血小板聚集儀(LBY-NJ4)，北京利普生醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)；掃描電鏡(SU-8010)，日本日立公司生產(chǎn)；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC/MS-8050)，日本島津公司生產(chǎn)。

1.4 造模與分組方法 健康雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模前禁食12 h。參照文獻(xiàn)報道方法[12]結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備心肌梗死模型。將造模成功大鼠隨機分為AMI模型組(model組)、ASA組、PNS組、PNS+ASA組。假手術(shù)組(sham組)只穿線不結(jié)扎。術(shù)后24h，ASA組給予ASA，負(fù)荷劑量31.25 mg/(kg·d)，給藥1 d，按正常成年人300 mg/(70 kg·d)換算；維持劑量10.42 mg/(kg·d) 給藥27 d，按正常成年人100 mg/(70 kg·d)換算。PNS組給予PNS 118.8 mg/(kg·d)，給藥4周；PNS+ASA組給予PNS聯(lián)合ASA 4周，sham組和model組給予等量生理鹽水灌胃4周。

1.5 取材與指標(biāo)檢測

1.5.1 心肌染色 灌胃4周后，禁食12 h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠固定于解剖臺。開胸取心臟并用生理鹽水沖洗，心臟-80 ℃冷凍10 min后，從結(jié)扎(或穿線)點起將心臟垂直長軸橫切為均勻厚度的5片，放置于1% TTC染液中，37 ℃恒溫孵育15 min，最后用生理鹽水漂洗心臟切片以終止染色。使用Image J 軟件計算心肌梗死范圍：左心室梗死區(qū)面積/(左心室總面積-左心室腔面積)×100%。

1.5.2 血小板聚集率 腹主動脈采血2 mL并用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，1 000 r/min 離心8 min，制備富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)，3 000 r/min離心10 min制備貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，使用PPP稀釋PRP至血小板濃度為1.5×109～1.8×109/mL，測定ADP(終濃度20 μmol/L)誘導(dǎo)的血小板最大聚集率(%)。

1.5.3 胃黏膜掃描電鏡檢測 取胃竇部黏膜(約0.4 cm×0.1cm×0.1cm)，生理鹽水漂洗后立即投入2.5%戊二醛中，4 ℃固定3 d，1%鋨酸固定2 h，乙醇逐級脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，黏臺后噴金，使用掃描電鏡觀察胃黏膜超微結(jié)構(gòu)。

1.5.4 ELISA、Western blot檢測COX-1 蛋白表達(dá) 將ACD抗凝劑(檸檬酸三鈉13.2 g/L，檸檬酸4.8 g/L，葡萄糖14.7 g/L)與改良臺式液以1∶9體積比混合制備血小板重懸液。腹主動脈取血2 mL并用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，1 000 r/min離心8 min 得到PRP，取離心管A、B，各加入PRP 100 μL，分別用于檢測COX-1活性及蛋白表達(dá)。PRP 3 000 r/min離心10 min，棄上清，獲得血小板沉淀。管A加入重懸液重懸血小板，室溫靜置10 min后加入0.1 mol/L冰鹽酸裂解血小板，10 000 r/min 離心10 min，提取上清液，嚴(yán)格按照COX-1熒光活性試劑盒說明書檢測，以AA誘導(dǎo)COX-1催化生成的下游代謝物PGG2反應(yīng)COX-1活性。管B中加入裂解液100 μL，冰浴裂解15 min后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取蛋白上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%分離膠)，然后將蛋白電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入COX-1抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過夜；洗膜后加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)，室溫孵育 1 h，洗膜后用ECL進(jìn)行顯影，X 光片壓片，曝光；利用 Image J 軟件對所得的條帶進(jìn)行分析。COX-1蛋白表達(dá)以COX-1/β-actin表示。

1.5.5 AA通路脂質(zhì)代謝物檢測

1.5.5.1 內(nèi)標(biāo)溶液配制 內(nèi)標(biāo)溶液包含血栓素B2(TXB2)-d4、PGE2-d4、PGD2-d4、LTB4 d4、15-HETE-d8。PGE2-d4濃度為2.5 μg/mL，余內(nèi)標(biāo)濃度均為25 μg/mL。混合內(nèi)標(biāo)避光、-80 ℃凍存。

1.5.5.2 樣本采集與前處理 腹主動脈采血2 mL并用肝素抗凝，3 000 r/min 離心15 min分離血清600 μL。腹主動脈取血2 mL并用3.8%枸櫞酸鈉抗凝制備血小板重懸液(離心條件同1.5.4)80 μL。刮取胃竇部黏膜50 mg。血清和胃黏膜樣本中均加入內(nèi)標(biāo)溶液600 μL，血小板樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，渦旋5 min，超聲3 min，10 000 r/min 離心5 min，提取上清液，上樣于固相萃取柱，0.1%甲酸淋洗，15%乙醇淋洗，200 μL甲醇洗脫后氮氣吹干濃縮，-80 ℃凍存待測。目標(biāo)代謝物為血小板TXB2，血清5，6-表氧二十碳三烯酸(EET)、8，9-EET、11，12-EET、14，15-EET，胃黏膜PGE2、13，14-dihydro-15-keto-PGE2。

1.5.5.3 LC/MS數(shù)據(jù)采集與處理 濃縮樣本使用100 μL甲醇復(fù)溶后置于進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣量：10 μL。LC條件：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈。梯度條件：0～<5 min(10%B)，5～<10 min(25%B)，10～<20 min(35%B)，20～<20.1 min(75%B)，20.1～<25(95%B)，25.1～30 min(10%B)。MS條件：離子化方式為ESI+/-，霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量10 L/min，加熱氣流量10 L/min，加熱模塊溫度400 ℃，接口溫度300 ℃，DL溫度250 ℃，CID氣壓力230 kPa。使用島津公司labsolution軟件讀取數(shù)據(jù)，調(diào)整保留時間、濾噪后分段積分，目標(biāo)代謝物水平以目標(biāo)代謝物峰面積/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積×100%表示。

2 結(jié) 果

2.1 心肌梗死面積 TTC染色后見梗死區(qū)域呈灰白色(紅色箭頭所示)，未梗死區(qū)域呈紅色(綠色箭頭所示)。與model組比較，PNS、ASA單獨及聯(lián)用均可明顯減少心肌梗死面積(P<0.01)，PNS聯(lián)合ASA較ASA相比，能進(jìn)一步減少心肌梗死面積(P<0.01)。詳見圖1、圖2。

A為sham組；B為model組；C為PNS組；D為ASA組；E為PNS+ASA組

A為sham組；B為model組；C為PNS組；D為ASA組；E為PNS+ASA組。與sham組比較，* P<0.01；與model組比較，#P<0.01；與ASA組比較，△ P<0.01

2.2 血小板聚集率 與sham組比較，model組血小板聚集率顯著升高(P<0.01)。與model組比較，PNS、ASA單獨及聯(lián)用均可降低ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率(P<0.01)，PNS聯(lián)合ASA與ASA單用比較，能進(jìn)一步降低ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率(P<0.05)。詳見表1。

組別只數(shù)血小板最大聚集率sham組10 53.25±6.65model組10 77.04±6.951)PNS組10 62.87±3.012)ASA組10 61.68±5.942)PNS+ASA組10 56.24±4.252)3)

與sham組比較，1)P<0.01；與model組比較，2)P<0.01；與ASA組比較，3)P<0.05

2.3 胃黏膜超微結(jié)構(gòu) 與model組比較，ASA組胃黏膜上皮細(xì)胞排列紊亂，上皮細(xì)胞脫落，固有層結(jié)締組織暴露；PNS+ASA組胃黏膜上皮細(xì)胞排列輕度紊亂，僅少量細(xì)胞脫落，且未見結(jié)締組織暴露。表明PNS聯(lián)合ASA可減輕ASA誘導(dǎo)的胃黏膜損傷。詳見圖3。

sham組 model組 PNS組 ASA組 PNS+ASA組

2.4 血小板COX-1活性和表達(dá) model組血小板COX-1活性及表達(dá)較sham組顯著上升(P<0.01)，ASA單獨及聯(lián)用PNS均可顯著降低血小板COX-1活性及表達(dá)(P<0.01)，PNS聯(lián)合ASA可進(jìn)一步降低血小板COX-1活性及表達(dá)(P<0.01)。此外，PNS抑制COX-1活性的水平優(yōu)于ASA(P<0.01)。詳見圖4、圖5。

A為sham組；B為model組；C為PNS組；D為ASA組；E為PNS+ASA組。與sham組比較，* P<0.01；與model組比較，#P<0.01；與ASA組比較，△ P<0.01

A為sham組；B為model組；C為PNS組；D為ASA組；E為PNS+ASA組。與sham組比較，* P<0.01；與model組比較，#P<0.01；與ASA組比較，△ P<0.01

2.5 AA通路脂質(zhì)代謝物分析 與ASA組相比，PNS+ASA組血小板中TXB2顯著降低(P<0.01)，PNS組、PNS+ASA組血清總EET水平顯著升高(P<0.01)。胃黏膜組織中，PNS組、PNS+ASA組PGE2及其下游代謝物13，14-dihydro-15-keto-PGE2水平均顯著高于ASA組(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組AA通路代謝物水平比較(±s)

注：血清總EET包括5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET、14，15-EET。代謝物水平以目標(biāo)代謝物峰面積/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積×100%表示。與ASA組比較，1)P<0.01

3 討 論

阿司匹林在心血管血栓性疾病防治中的臨床療效已得到廣泛證實。然而，服用阿司匹林后血小板高反應(yīng)性和胃腸道損傷是臨床使用中面臨的突出問題。在服用ASA的病人中5%～45%存在阿司匹林低反應(yīng)性[13]。薈萃研究表明，阿司匹林低反應(yīng)性與動脈粥樣硬化血栓性事件風(fēng)險增高有關(guān)[14]。即使是低劑量阿司匹林，也會增加胃腸道嚴(yán)重出血風(fēng)險[15]。一項納入187例的多中心隊列研究表明，服用低劑量阿司匹林(75～325 mg/d)的病人胃、十二指腸潰瘍3個月發(fā)病率達(dá)7.1%[16]。多中心病例對照研究顯示，低劑量服用阿司匹林(<300 mg/d)使上消化道出血風(fēng)險升高1倍[17]。阿司匹林引起的胃腸道損傷和出血是冠心病預(yù)后不良的獨立危險因素[18]，是導(dǎo)致病人服藥依從性差甚至停藥的最主要原因。如何增強阿司匹林抗血小板作用、減輕阿司匹林造成的胃腸道損傷，是亟待解決的臨床問題。

三七是化瘀止血的代表藥，兼具活血和止血之功效?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》記載，“三七，善化瘀血，又善止血妄行”。PNS是三七的有效組分。一項采用PNS和阿司匹林進(jìn)行雙盲雙模擬的隨機對照臨床研究證實，PNS能有效降低血小板聚集率和血小板體外黏附；PNS對血小板CD62p、血小板膜糖蛋白 GPⅡb/Ⅲa的抑制作用均優(yōu)于阿司匹林[19]。一項采用PNS聯(lián)合雙抗(阿司匹林+氯吡格雷)進(jìn)行的隨機對照臨床研究證實，PNS與雙抗相比，能進(jìn)一步抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率，減少心血管事件和消化道出血事件[20]。但目前PNS對血小板和胃黏膜的作用機制認(rèn)識有限，制約了其臨床應(yīng)用。

AA代謝通路是存在于血小板、胃黏膜上皮的共同通路。AA在COX催化下生成TXA2、PGs；在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、細(xì)胞色素P450酶作用下產(chǎn)生羥基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acids，HETEs)、白三烯(leukotriens，LTs)、表氧二十碳三烯酸。AA下游多種代謝產(chǎn)物與血小板功能密切相關(guān)。TXA2是強大的血小板激動劑，對血小板活化起正反饋調(diào)控作用。前列環(huán)素I2(PGI2)主要來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是TXA2的拮抗劑，具有抗血小板聚集、調(diào)控血管的張力作用[21]，TXB2是其穩(wěn)定代謝產(chǎn)物。PGD2由肥大細(xì)胞和活化血小板合成，在血漿中較PGI2更穩(wěn)定，具有抑制血小板聚集、舒張血管的作用[22]。表氧二十碳三烯酸能誘導(dǎo)血管舒張，抑制血小板聚集，促進(jìn)纖維蛋白溶解[23]。AA下游代謝產(chǎn)物PGs通過降低胃黏膜上皮細(xì)胞通透性、抑制胃酸和HCO3-分泌、增加胃黏膜血流、抑制炎性因子釋放的形式發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用，還能促進(jìn)潰瘍愈合，以前列環(huán)素E2及其衍生物的效應(yīng)最強[24]。

本研究通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型。model組與sham組相比，血小板聚集率明顯升高(P<0.01)，PNS聯(lián)合ASA與ASA單用相比，血小板最大聚集率降低(P<0.05)，且左室心肌梗死面積降低(P<0.01)，表明PNS聯(lián)合ASA能進(jìn)一步抑制血小板聚集、縮小心肌梗死范圍。與ASA組相比，PNS聯(lián)合ASA能進(jìn)一步降低血小板COX-1表達(dá)及活性(P<0.01)、血小板TXB2水平(P<0.01)，提示PNS與ASA聯(lián)用后，可能通過COX-1抑制途徑，增強抗血小板聚集作用。

課題組前期內(nèi)皮細(xì)胞研究顯示，PNS對血小板黏附有明顯抑制作用[19]，且優(yōu)于ASA[6]。EET能抑制血小板黏附分子表達(dá)、抑制血小板黏附于內(nèi)皮細(xì)胞[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，PNS抑制COX-1活性的作用優(yōu)于ASA(P<0.01)，PNS組血清總EET含量高于ASA組(P<0.01)，提示PNS對COX及CYP途徑代謝物的調(diào)控作用可能是其抑制血小板黏附和聚集的潛在機制之一。

本研究通過掃描電鏡觀察ASA誘導(dǎo)的胃黏膜上皮損傷以及PNS對胃黏膜上皮的保護(hù)作用。sham組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，絨毛致密。ASA組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞排列紊亂，大量細(xì)胞損傷、脫落，可見固有層結(jié)締組織暴露。ASA聯(lián)合PNS干預(yù)后，胃黏膜上皮細(xì)胞損傷有所緩解，見部分細(xì)胞絨毛缺損，未見細(xì)胞脫落及固有層結(jié)締組織暴露，且胃黏膜上皮細(xì)胞PGE2及其下游代謝產(chǎn)物13，14-dihydro-15-keto-PGE2較ASA組上升(P<0.01)，提示PNS可能通過對胃黏膜上皮細(xì)胞PG代謝的調(diào)控，緩解ASA誘導(dǎo)的胃黏膜損傷。

本研究表明PNS能增強ASA抗血小板作用，減輕ASA造成的胃黏膜損傷，機制可能與調(diào)控血小板AA通路COX-1和CYP途徑代謝、調(diào)控胃黏膜PGE2代謝有關(guān)，為PNS聯(lián)合ASA的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。