曾本和,王萬(wàn)良,周建設(shè),張忭忭,王金林, 劉海平,牟振波
(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所,西藏 拉薩 850032;2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院,西藏 拉薩 850000)
異齒裂腹魚(yú)(SchizothoraxoconnoriLloyd)隸屬鯉科(Cyprindiae)裂腹魚(yú)亞科(Schizothracinae)裂腹魚(yú)屬(Schizothorax),別名棒棒魚(yú),分布于雅魯藏布江上、中游的干支流及附屬水體,占雅魯藏布江漁獲物的35%~42%[1],為產(chǎn)區(qū)主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一[2-4].雅魯藏布江屬于高原河流,餌料較少,生態(tài)脆弱;同時(shí)水溫低,魚(yú)生長(zhǎng)慢,性成熟周期長(zhǎng).如果魚(yú)類(lèi)生態(tài)被破壞,將極難恢復(fù).目前雅魯藏布江水域生態(tài)正遭受?chē)?yán)峻的考驗(yàn),首先,雅魯藏布江上的水電站建成將導(dǎo)致水域環(huán)境改變,生境片段化,極大威脅到土著魚(yú)類(lèi).其次,隨著經(jīng)濟(jì)、旅游業(yè)的發(fā)展和內(nèi)地人口的遷入,近年來(lái)對(duì)西藏魚(yú)類(lèi)需求越來(lái)越大,出現(xiàn)了過(guò)度捕撈的現(xiàn)象,同時(shí)生活污水的排入,極大影響了西藏土著魚(yú)類(lèi)資源量.再者,近年來(lái)雅魯藏布江外來(lái)物種入侵嚴(yán)重,導(dǎo)致西藏本土魚(yú)生存空間大大減少,土著魚(yú)類(lèi)資源量嚴(yán)重縮減.20世紀(jì)70年代末,雅魯藏布江的裂腹魚(yú)類(lèi)體質(zhì)量為500~1 000 g/尾,2010年漁獲物體質(zhì)量為200~709 g/尾[1],這說(shuō)明雅魯藏布江裂腹魚(yú)資源量正在小型化.雖然異齒裂腹魚(yú)人工繁殖成功,但規(guī)?;庇钠款i尚未攻坡.人工繁育過(guò)程中水霉嚴(yán)重,導(dǎo)致魚(yú)卵孵化率極低,造成大量經(jīng)濟(jì)損失.
水霉病是淡水魚(yú)繁育過(guò)程中的常見(jiàn)病害之一,其病原是水霉(Saprolegnia),隸屬于茸鞭生物界(Stramenopila)水霉目(Saprolegniales)水霉科(Sprolegniaceae)[5].孔雀石綠是治療水霉病的有效藥物,但由于該藥具有高毒性,高殘留等問(wèn)題[8-9],2002年被農(nóng)業(yè)部列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》.生產(chǎn)上雖然也使用過(guò)氧化氫、臭氧、氯化鈉、福爾馬林、腐植酸等化學(xué)藥物,但是這些藥物缺乏高效性,并且安全風(fēng)險(xiǎn)較高而未得到廣泛認(rèn)可[10-12].中草藥具有安全、有效、毒副作用小、無(wú)二次污染、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn).有關(guān)中草藥防治水產(chǎn)動(dòng)物水霉病已有先例報(bào)道[13-14].
本試驗(yàn)以異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵為研究對(duì)象,選擇5種中藥設(shè)置梯度試驗(yàn),從異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵到孵化出膜,每天用不同濃度的5種中藥浸泡,計(jì)算孵化率、畸形率、死卵率、水霉致死率和其他因素致死率,探討5種中草藥預(yù)防水霉傳染效果,為異齒裂腹魚(yú)水霉病防治提供參考依據(jù).
異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵取自2017年4月在西藏自治區(qū)拉薩市曲水縣西藏土著魚(yú)類(lèi)增殖育種場(chǎng)繁殖的同一批魚(yú)卵5.4萬(wàn)粒(2條魚(yú)的混合魚(yú)卵),平均受精率87%,為非粘性卵.將魚(yú)卵平均分為27組,每組2個(gè)平行,每個(gè)平行1 000粒卵.將魚(yú)卵放入孵化框放在4.3 m×2.7 m×0.5 m的水泥池中孵化.孵化用水為井水,井水在蓄水池中充分曝氣,曝氣后井水溶氧為8.5~9.9 mg/L;孵化水泥池微流水,水體每30 min交換1次,使孵化水體溶氧保持在6 mg/L以上;孵化期間井水水溫保持恒定,為(13.3±0.2)℃.
5種中草藥購(gòu)自于重慶長(zhǎng)圣醫(yī)藥公司中藥部.分別稱(chēng)取5種中藥,加10倍量的水浸泡1 h,文火煎煮1 h,60目紗布過(guò)濾,濾液保存;藥渣加10倍重量水,進(jìn)行第2次文火煎煮45 min,60目紗布過(guò)濾,濾液保存.藥渣再加10倍重量水,進(jìn)行第3次文火煎煮30 min,60目紗布過(guò)濾,濾液保存.將3次濾液合并,得到5種中藥的提取物.
5種中藥均設(shè)置5個(gè)濃度梯度,同時(shí)設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照(空白對(duì)照,沒(méi)有任何藥物浸泡)和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)量濃度為4 mg/L孔雀石綠),分組設(shè)置如表1所示.將藥液換算為中藥重量,按照表格中的比例在孵化盆中配備,將孵化框轉(zhuǎn)移到孵化盆中浸泡35 min[15],浸泡過(guò)程中曝氣增氧,使水體溶氧含量保持在6 mg/L以上,浸泡結(jié)束再將孵化框轉(zhuǎn)移到孵化池中.
表1 試驗(yàn)分組
從魚(yú)卵形成至出膜期間,每天浸泡1次(9∶30~10∶05).每日藥浴前進(jìn)行活卵、水霉致死死卵(解剖鏡鏡檢,卵膜有水霉穿透)及其他因素致死(解剖鏡鏡檢,卵膜及胚胎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)水霉)計(jì)數(shù).試驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)每組出膜魚(yú)苗及畸形魚(yú)苗(身體畸形)進(jìn)行計(jì)數(shù),孵化魚(yú)卵總數(shù)為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)投放魚(yú)卵數(shù).
孵化率(%)=孵化魚(yú)苗數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%
死卵率(%)=死卵數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%
水霉致死率(%)=水霉致死卵數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%
其他因素致死率(%)=其他因素致死卵數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%
畸形率(%)=畸形魚(yú)苗數(shù)/出膜魚(yú)苗數(shù)×100%
試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA進(jìn)行方差分析,若組間差異顯著,再用Duncan氏進(jìn)行多重比較,差異顯著水平為α=0.05.
對(duì)照組對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵的作用見(jiàn)圖1.五倍子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果見(jiàn)圖2.五倍子浸泡組魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率(表2)均顯著高于陰性對(duì)照組,低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05);水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組,高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度五倍子浸泡組中,1.5 g/L五倍子組水霉致死率最低,與2.4 g/L五倍子組效果差異不顯著(P>0.05),顯著低于0.7、1.1和1.9 g/L五倍子組(P<0.05).0.7 g/L五倍子組孵化率最高,與1.1、2.4 g/L五倍子組差異不顯著(P>0.05),顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.7 g/L五倍子組魚(yú)苗畸形率最低,與1.1 g/L五倍子組差異不顯著(P>0.05),顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率,五倍子適宜浸泡濃度為0.7、1.1、1.5 g/L.
表2 各試驗(yàn)組死卵率、孵化率及畸形率統(tǒng)計(jì)表
同列相同小寫(xiě)字母或沒(méi)有字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).
The same letter or no letter in the same column indicate no significant difference(P>0.05),the different letters indicate significant difference (P<0.05).
大黃對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖3所示.大黃浸泡組魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2),低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05);水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組,高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度大黃浸泡組中,0.4 g/L大黃組水霉致死率最低,與0.7 g/L大黃組差異不顯著(P>0.05),顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.4 g/L大黃組孵化率最高,與0.1 g/L大黃組差異不顯著(P>0.05),顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.1 g/L大黃組魚(yú)苗畸形率最低,顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05);其次為0.4 g/L大黃組,顯著高于0.1 g/L大黃組(P<0.05),顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率,大黃適宜浸泡濃度為0.1、0.4 g/L.
圖1 陰性和陽(yáng)性對(duì)照組異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵情況Figure 1 The situation ofSchizothorax oconnorifertilized eggs between negative and positive control groups
圖2 五倍子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 2 The prevention and treatment effects ofRhus Chinensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori
圖3 大黃對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 3 The prevention and treatment effects of Chinese rhubarb onSaprolegniaofSchizothorax oconnori
山蒼子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖4所示.山蒼子浸泡組魚(yú)苗畸形率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2),低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05);水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組,高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05);魚(yú)卵孵化率部分高于陽(yáng)性對(duì)照組.不同濃度山蒼子浸泡組中,0.6 g/L山蒼子組水霉致死率最低,與1.1、1.6、2.1 g/L山蒼子組差異不顯著(P>0.05),顯著低于0.1 g/L山蒼子組(P<0.05).0.6 g/L山蒼子組孵化率最高,與1.1、1.6 g/L山蒼子組差異不顯著(P>0.05),顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.6 g/L山蒼子組魚(yú)苗畸形率最低,顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率,山蒼子適宜浸泡濃度為0.6 g/L.
圖4 山蒼子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 4 The prevention and treatment effects ofLitsea cubebaon fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori
黃芩對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖5所示.黃芩浸泡組魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2)(P<0.05);水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組,高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度黃芩浸泡組中,1.5 g/L黃芩組水霉致死率最低,顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).1.2 g/L黃芩組孵化率最高,顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.6 g/L黃芩組魚(yú)苗畸形率最低,顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率,黃芩適宜浸泡濃度為0.6、0.9、1.2、1.5 g/L.
苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖6所示.苦參浸泡組魚(yú)苗畸形率及魚(yú)卵孵化率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2)(P<0.05);水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組,高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度苦參浸泡組中,1.2 g/L苦參組水霉致死率最低,顯著低于其他試驗(yàn)組.1.5 g/L苦參組孵化率最高,但各試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05).0.9 g/L苦參組魚(yú)苗畸形率最低,顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率,苦參適宜浸泡濃度為0.9、1.2、1.5 g/L.
圖5 黃芩對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 5 The prevention and treatment effects ofScutellaria baicalensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori
圖6 苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 6 The prevention and treatment effects ofSophora flavescenson fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori
五倍子有效成分包含鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸、槲皮素、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素和1,8-二羥基蒽醌等[16],抑制真菌生長(zhǎng)[17].對(duì)多鱗鏟頜魚(yú)(Varicorhinusmacrolepis)水霉病的藥物篩選及其藥效研究發(fā)現(xiàn)五倍子無(wú)論是單獨(dú)用藥還是聯(lián)合用藥,都有較好的抗水霉菌效果[18].0.64 mg/mL的五倍子水提取物可有效抑制水霉孢子萌發(fā)[13],對(duì)致病水霉菌的抑菌率可達(dá)37.92%[19].在本試驗(yàn)中,五倍子試驗(yàn)組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了17.22%~25.12%,水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了26.11%~31.35%,并且五倍子對(duì)魚(yú)卵影響小,魚(yú)苗畸形率與陰性對(duì)照組差異不顯著,因此五倍子在未來(lái)的抗水霉藥物研發(fā)中有較大的應(yīng)用潛力,可用于水霉病的防控及治療.
大黃有效成分提取物中含大黃素、大黃酸、大黃酚等物質(zhì)[20],具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生長(zhǎng)等藥理作用[21].研究發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)山女鱒(Oncorhynchusmasou)水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.馬江耀[19]研究發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)致病水霉菌的抑菌率可達(dá)40.76%.在本試驗(yàn)中大黃實(shí)驗(yàn)組魚(yú)卵水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組,0.1、0.4 g/L大黃組魚(yú)卵孵化率顯著高于陰性對(duì)照組.因此,大黃可作為異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治參考藥物.
山蒼子果實(shí)可提煉出山蒼子精油,其檸檬醛含量約為60%~80%,山蒼子精油具有很好的抗氧化和抗菌性能,已被國(guó)內(nèi)外較多學(xué)者證實(shí)[22].沈琦[23]在對(duì)羅非魚(yú)(Oreochromisspp)和鰻鱺(AnguillajaponicaTemminck et Schlegel)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)山蒼子具有較好抑殺水霉能力.馬江耀[19]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子對(duì)致病水霉菌的抑菌率可達(dá)46.75%.在本試驗(yàn)中,山蒼子試驗(yàn)組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了24.20%~34.58%,水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了27.92%~31.42%.因此山倉(cāng)子可作為防治魚(yú)卵水霉的特效中藥.
黃芩有效成分提取物中含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素,具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生長(zhǎng)等作用[20].藺凌云等[13]研究發(fā)現(xiàn)0.64 mg/mL的黃芩水提取物可有效抑制水霉孢子萌發(fā).甄珍[24]研究表明黃芩對(duì)山女鱒水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.在本試驗(yàn)中,黃芩試驗(yàn)組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了19.24%~32.40%,水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了29.55%~31.62%.因此黃芩可作為防治魚(yú)卵水霉的特效中藥.
苦參有效成分提取物中含有苦楝素物質(zhì)具有抑制真菌生長(zhǎng)的作用[21,25].劉榮軍[26]、沈琦等[23]研究均發(fā)現(xiàn)苦參對(duì)水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.在本試驗(yàn)中,黃芩組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了19.24%~31.44%,水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了27.09%~32.07%.但甄珍[27]研究發(fā)現(xiàn)苦參對(duì)山女鱒水霉菌絲幾乎無(wú)抑制作用.可能是因?yàn)榧逯蠓椒▽?dǎo)致藥液中有效成分失活,或者是水霉品種不同,而苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉菌絲有抑制和殺滅作用,但對(duì)山女鱒水霉菌絲無(wú)效.
本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),1.5 g/L五倍子組,0.4、0.7 g/L大黃組,0.6、1.1、1.6 g/L山蒼子組,本試驗(yàn)所有濃度黃芩組,1.2、1.5、1.8 g/L苦參組魚(yú)卵水霉致死率較低,與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05).0.7 g/L五倍子組,0.1、0.4 g/L大黃組,本試驗(yàn)所有濃度山蒼子組,1.2、1.5、1.8 g/L黃芩組,本試驗(yàn)所有濃度苦參組魚(yú)卵孵化率均較高,與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05).本試驗(yàn)所有濃度五倍子組,0.1、0.4、0.7 g/L大黃組,0.6 g/L山蒼子組,0.6、0.9 g/L黃芩組,0.9、1.2 g/L苦參組魚(yú)苗畸形率均較低.平均孵化率苦參組>山蒼子組>黃芩組>五倍子組>大黃組;魚(yú)苗畸形率五倍子組<大黃組<山蒼子組<苦參組<黃芩組.中草藥成分較為復(fù)雜,其部分組成成分對(duì)魚(yú)卵具有危害,導(dǎo)致異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率存在差異,其具體原因有待進(jìn)一步研究.因此,為了避免中草藥部分成分對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵及魚(yú)苗造成損傷,下一步需要對(duì)中草藥成分進(jìn)行分離,探索可以防治其魚(yú)卵水霉的有效成分以及對(duì)其魚(yú)卵及魚(yú)苗造成損傷的成分,從而推動(dòng)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治特效藥開(kāi)發(fā).
五倍子、大黃、山蒼子、黃芩、苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉均具有很好的抑制和殺滅效果,最佳浸泡濃度為 0.7、1.1、1.5 g/L五倍了組,0.1、0.4 g/L大黃組,0.6 g/L山蒼子組,0.6、0.9、1.2、1.5 g/L黃岑組,0.9、1.2、1.5 g/L苦參組.在孔雀石綠被禁用的現(xiàn)實(shí)情況下,這幾種藥可作為防治異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉提供參考依據(jù).