曾本和，王萬(wàn)良，周建設(shè)，張忭忭，王金林， 劉海平，牟振波

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000)

異齒裂腹魚(yú)(SchizothoraxoconnoriLloyd)隸屬鯉科(Cyprindiae)裂腹魚(yú)亞科(Schizothracinae)裂腹魚(yú)屬(Schizothorax)，別名棒棒魚(yú)，分布于雅魯藏布江上、中游的干支流及附屬水體，占雅魯藏布江漁獲物的35%～42%[1]，為產(chǎn)區(qū)主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一[2-4].雅魯藏布江屬于高原河流，餌料較少，生態(tài)脆弱；同時(shí)水溫低，魚(yú)生長(zhǎng)慢，性成熟周期長(zhǎng).如果魚(yú)類(lèi)生態(tài)被破壞，將極難恢復(fù).目前雅魯藏布江水域生態(tài)正遭受?chē)?yán)峻的考驗(yàn)，首先，雅魯藏布江上的水電站建成將導(dǎo)致水域環(huán)境改變，生境片段化，極大威脅到土著魚(yú)類(lèi).其次，隨著經(jīng)濟(jì)、旅游業(yè)的發(fā)展和內(nèi)地人口的遷入，近年來(lái)對(duì)西藏魚(yú)類(lèi)需求越來(lái)越大，出現(xiàn)了過(guò)度捕撈的現(xiàn)象，同時(shí)生活污水的排入，極大影響了西藏土著魚(yú)類(lèi)資源量.再者，近年來(lái)雅魯藏布江外來(lái)物種入侵嚴(yán)重，導(dǎo)致西藏本土魚(yú)生存空間大大減少，土著魚(yú)類(lèi)資源量嚴(yán)重縮減.20世紀(jì)70年代末，雅魯藏布江的裂腹魚(yú)類(lèi)體質(zhì)量為500～1 000 g/尾，2010年漁獲物體質(zhì)量為200～709 g/尾[1]，這說(shuō)明雅魯藏布江裂腹魚(yú)資源量正在小型化.雖然異齒裂腹魚(yú)人工繁殖成功，但規(guī)?；庇钠款i尚未攻坡.人工繁育過(guò)程中水霉嚴(yán)重，導(dǎo)致魚(yú)卵孵化率極低，造成大量經(jīng)濟(jì)損失.

水霉病是淡水魚(yú)繁育過(guò)程中的常見(jiàn)病害之一，其病原是水霉(Saprolegnia)，隸屬于茸鞭生物界(Stramenopila)水霉目(Saprolegniales)水霉科(Sprolegniaceae)[5].孔雀石綠是治療水霉病的有效藥物，但由于該藥具有高毒性，高殘留等問(wèn)題[8-9]，2002年被農(nóng)業(yè)部列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》.生產(chǎn)上雖然也使用過(guò)氧化氫、臭氧、氯化鈉、福爾馬林、腐植酸等化學(xué)藥物，但是這些藥物缺乏高效性，并且安全風(fēng)險(xiǎn)較高而未得到廣泛認(rèn)可[10-12].中草藥具有安全、有效、毒副作用小、無(wú)二次污染、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn).有關(guān)中草藥防治水產(chǎn)動(dòng)物水霉病已有先例報(bào)道[13-14].

本試驗(yàn)以異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵為研究對(duì)象，選擇5種中藥設(shè)置梯度試驗(yàn)，從異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵到孵化出膜，每天用不同濃度的5種中藥浸泡，計(jì)算孵化率、畸形率、死卵率、水霉致死率和其他因素致死率，探討5種中草藥預(yù)防水霉傳染效果，為異齒裂腹魚(yú)水霉病防治提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 魚(yú)卵及孵化條件

異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵取自2017年4月在西藏自治區(qū)拉薩市曲水縣西藏土著魚(yú)類(lèi)增殖育種場(chǎng)繁殖的同一批魚(yú)卵5.4萬(wàn)粒(2條魚(yú)的混合魚(yú)卵)，平均受精率87%，為非粘性卵.將魚(yú)卵平均分為27組，每組2個(gè)平行，每個(gè)平行1 000粒卵.將魚(yú)卵放入孵化框放在4.3 m×2.7 m×0.5 m的水泥池中孵化.孵化用水為井水，井水在蓄水池中充分曝氣，曝氣后井水溶氧為8.5～9.9 mg/L；孵化水泥池微流水，水體每30 min交換1次，使孵化水體溶氧保持在6 mg/L以上；孵化期間井水水溫保持恒定，為(13.3±0.2)℃.

1.2 中藥的制備

5種中草藥購(gòu)自于重慶長(zhǎng)圣醫(yī)藥公司中藥部.分別稱(chēng)取5種中藥，加10倍量的水浸泡1 h，文火煎煮1 h，60目紗布過(guò)濾，濾液保存；藥渣加10倍重量水，進(jìn)行第2次文火煎煮45 min，60目紗布過(guò)濾，濾液保存.藥渣再加10倍重量水，進(jìn)行第3次文火煎煮30 min，60目紗布過(guò)濾，濾液保存.將3次濾液合并，得到5種中藥的提取物.

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

5種中藥均設(shè)置5個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照(空白對(duì)照，沒(méi)有任何藥物浸泡)和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)量濃度為4 mg/L孔雀石綠)，分組設(shè)置如表1所示.將藥液換算為中藥重量，按照表格中的比例在孵化盆中配備，將孵化框轉(zhuǎn)移到孵化盆中浸泡35 min[15]，浸泡過(guò)程中曝氣增氧，使水體溶氧含量保持在6 mg/L以上，浸泡結(jié)束再將孵化框轉(zhuǎn)移到孵化池中.

表1 試驗(yàn)分組

1.4 指標(biāo)測(cè)定

從魚(yú)卵形成至出膜期間，每天浸泡1次(9∶30～10∶05).每日藥浴前進(jìn)行活卵、水霉致死死卵(解剖鏡鏡檢，卵膜有水霉穿透)及其他因素致死(解剖鏡鏡檢，卵膜及胚胎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)水霉)計(jì)數(shù).試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)每組出膜魚(yú)苗及畸形魚(yú)苗(身體畸形)進(jìn)行計(jì)數(shù)，孵化魚(yú)卵總數(shù)為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)投放魚(yú)卵數(shù).

孵化率(%)=孵化魚(yú)苗數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%

死卵率(%)=死卵數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%

水霉致死率(%)=水霉致死卵數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%

其他因素致死率(%)=其他因素致死卵數(shù)/孵化魚(yú)卵總數(shù)×100%

畸形率(%)=畸形魚(yú)苗數(shù)/出膜魚(yú)苗數(shù)×100%

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，若組間差異顯著，再用Duncan氏進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為α=0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉的防治效果

對(duì)照組對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵的作用見(jiàn)圖1.五倍子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果見(jiàn)圖2.五倍子浸泡組魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率(表2)均顯著高于陰性對(duì)照組，低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組，高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度五倍子浸泡組中，1.5 g/L五倍子組水霉致死率最低，與2.4 g/L五倍子組效果差異不顯著(P>0.05)，顯著低于0.7、1.1和1.9 g/L五倍子組(P<0.05).0.7 g/L五倍子組孵化率最高，與1.1、2.4 g/L五倍子組差異不顯著(P>0.05)，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.7 g/L五倍子組魚(yú)苗畸形率最低，與1.1 g/L五倍子組差異不顯著(P>0.05)，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率，五倍子適宜浸泡濃度為0.7、1.1、1.5 g/L.

表2 各試驗(yàn)組死卵率、孵化率及畸形率統(tǒng)計(jì)表

同列相同小寫(xiě)字母或沒(méi)有字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).

The same letter or no letter in the same column indicate no significant difference(P>0.05)，the different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.2 大黃對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

大黃對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖3所示.大黃浸泡組魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2)，低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組，高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度大黃浸泡組中，0.4 g/L大黃組水霉致死率最低，與0.7 g/L大黃組差異不顯著(P>0.05)，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.4 g/L大黃組孵化率最高，與0.1 g/L大黃組差異不顯著(P>0.05)，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.1 g/L大黃組魚(yú)苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05)；其次為0.4 g/L大黃組，顯著高于0.1 g/L大黃組(P<0.05)，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率，大黃適宜浸泡濃度為0.1、0.4 g/L.

圖1 陰性和陽(yáng)性對(duì)照組異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵情況Figure 1 The situation ofSchizothorax oconnorifertilized eggs between negative and positive control groups

圖2 五倍子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 2 The prevention and treatment effects ofRhus Chinensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

圖3 大黃對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 3 The prevention and treatment effects of Chinese rhubarb onSaprolegniaofSchizothorax oconnori

2.3 山蒼子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

山蒼子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖4所示.山蒼子浸泡組魚(yú)苗畸形率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2)，低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組，高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；魚(yú)卵孵化率部分高于陽(yáng)性對(duì)照組.不同濃度山蒼子浸泡組中，0.6 g/L山蒼子組水霉致死率最低，與1.1、1.6、2.1 g/L山蒼子組差異不顯著(P>0.05)，顯著低于0.1 g/L山蒼子組(P<0.05).0.6 g/L山蒼子組孵化率最高，與1.1、1.6 g/L山蒼子組差異不顯著(P>0.05)，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.6 g/L山蒼子組魚(yú)苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率，山蒼子適宜浸泡濃度為0.6 g/L.

圖4 山蒼子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 4 The prevention and treatment effects ofLitsea cubebaon fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

2.4 黃芩對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

黃芩對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖5所示.黃芩浸泡組魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2)(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組，高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度黃芩浸泡組中，1.5 g/L黃芩組水霉致死率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).1.2 g/L黃芩組孵化率最高，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.6 g/L黃芩組魚(yú)苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率，黃芩適宜浸泡濃度為0.6、0.9、1.2、1.5 g/L.

2.5 苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果如圖6所示.苦參浸泡組魚(yú)苗畸形率及魚(yú)卵孵化率均顯著高于陰性對(duì)照組(表2)(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組，高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05).不同濃度苦參浸泡組中，1.2 g/L苦參組水霉致死率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組.1.5 g/L苦參組孵化率最高，但各試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05).0.9 g/L苦參組魚(yú)苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉致死率、孵化率及魚(yú)苗畸形率，苦參適宜浸泡濃度為0.9、1.2、1.5 g/L.

圖5 黃芩對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 5 The prevention and treatment effects ofScutellaria baicalensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

圖6 苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果Figure 6 The prevention and treatment effects ofSophora flavescenson fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

3 討論

3.1 五倍子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

五倍子有效成分包含鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸、槲皮素、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素和1,8-二羥基蒽醌等[16]，抑制真菌生長(zhǎng)[17].對(duì)多鱗鏟頜魚(yú)(Varicorhinusmacrolepis)水霉病的藥物篩選及其藥效研究發(fā)現(xiàn)五倍子無(wú)論是單獨(dú)用藥還是聯(lián)合用藥，都有較好的抗水霉菌效果[18].0.64 mg/mL的五倍子水提取物可有效抑制水霉孢子萌發(fā)[13]，對(duì)致病水霉菌的抑菌率可達(dá)37.92%[19].在本試驗(yàn)中，五倍子試驗(yàn)組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了17.22%～25.12%，水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了26.11%～31.35%，并且五倍子對(duì)魚(yú)卵影響小，魚(yú)苗畸形率與陰性對(duì)照組差異不顯著，因此五倍子在未來(lái)的抗水霉藥物研發(fā)中有較大的應(yīng)用潛力，可用于水霉病的防控及治療.

3.2 大黃對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

大黃有效成分提取物中含大黃素、大黃酸、大黃酚等物質(zhì)[20]，具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生長(zhǎng)等藥理作用[21].研究發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)山女鱒(Oncorhynchusmasou)水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.馬江耀[19]研究發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)致病水霉菌的抑菌率可達(dá)40.76%.在本試驗(yàn)中大黃實(shí)驗(yàn)組魚(yú)卵水霉致死率均顯著低于陰性對(duì)照組，0.1、0.4 g/L大黃組魚(yú)卵孵化率顯著高于陰性對(duì)照組.因此，大黃可作為異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治參考藥物.

3.3 山蒼子對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

山蒼子果實(shí)可提煉出山蒼子精油，其檸檬醛含量約為60%～80%，山蒼子精油具有很好的抗氧化和抗菌性能，已被國(guó)內(nèi)外較多學(xué)者證實(shí)[22].沈琦[23]在對(duì)羅非魚(yú)(Oreochromisspp)和鰻鱺(AnguillajaponicaTemminck et Schlegel)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)山蒼子具有較好抑殺水霉能力.馬江耀[19]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子對(duì)致病水霉菌的抑菌率可達(dá)46.75%.在本試驗(yàn)中，山蒼子試驗(yàn)組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了24.20%～34.58%，水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了27.92%～31.42%.因此山倉(cāng)子可作為防治魚(yú)卵水霉的特效中藥.

3.4 黃芩對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

黃芩有效成分提取物中含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素，具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生長(zhǎng)等作用[20].藺凌云等[13]研究發(fā)現(xiàn)0.64 mg/mL的黃芩水提取物可有效抑制水霉孢子萌發(fā).甄珍[24]研究表明黃芩對(duì)山女鱒水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.在本試驗(yàn)中，黃芩試驗(yàn)組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了19.24%～32.40%，水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了29.55%～31.62%.因此黃芩可作為防治魚(yú)卵水霉的特效中藥.

3.5 苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果

苦參有效成分提取物中含有苦楝素物質(zhì)具有抑制真菌生長(zhǎng)的作用[21,25].劉榮軍[26]、沈琦等[23]研究均發(fā)現(xiàn)苦參對(duì)水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.在本試驗(yàn)中，黃芩組魚(yú)卵孵化率較陰性對(duì)照組提高了19.24%～31.44%，水霉感染致死率較陰性對(duì)照組降低了27.09%～32.07%.但甄珍[27]研究發(fā)現(xiàn)苦參對(duì)山女鱒水霉菌絲幾乎無(wú)抑制作用.可能是因?yàn)榧逯蠓椒▽?dǎo)致藥液中有效成分失活，或者是水霉品種不同，而苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉菌絲有抑制和殺滅作用，但對(duì)山女鱒水霉菌絲無(wú)效.

3.6 5種中草藥對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治效果比較

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),1.5 g/L五倍子組，0.4、0.7 g/L大黃組，0.6、1.1、1.6 g/L山蒼子組，本試驗(yàn)所有濃度黃芩組，1.2、1.5、1.8 g/L苦參組魚(yú)卵水霉致死率較低，與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05).0.7 g/L五倍子組，0.1、0.4 g/L大黃組，本試驗(yàn)所有濃度山蒼子組，1.2、1.5、1.8 g/L黃芩組，本試驗(yàn)所有濃度苦參組魚(yú)卵孵化率均較高，與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05).本試驗(yàn)所有濃度五倍子組，0.1、0.4、0.7 g/L大黃組，0.6 g/L山蒼子組，0.6、0.9 g/L黃芩組，0.9、1.2 g/L苦參組魚(yú)苗畸形率均較低.平均孵化率苦參組>山蒼子組>黃芩組>五倍子組>大黃組；魚(yú)苗畸形率五倍子組<大黃組<山蒼子組<苦參組<黃芩組.中草藥成分較為復(fù)雜，其部分組成成分對(duì)魚(yú)卵具有危害，導(dǎo)致異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵孵化率及魚(yú)苗畸形率存在差異，其具體原因有待進(jìn)一步研究.因此，為了避免中草藥部分成分對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵及魚(yú)苗造成損傷，下一步需要對(duì)中草藥成分進(jìn)行分離，探索可以防治其魚(yú)卵水霉的有效成分以及對(duì)其魚(yú)卵及魚(yú)苗造成損傷的成分，從而推動(dòng)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉防治特效藥開(kāi)發(fā).

4 結(jié)論

五倍子、大黃、山蒼子、黃芩、苦參對(duì)異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉均具有很好的抑制和殺滅效果，最佳浸泡濃度為 0.7、1.1、1.5 g/L五倍了組，0.1、0.4 g/L大黃組，0.6 g/L山蒼子組，0.6、0.9、1.2、1.5 g/L黃岑組，0.9、1.2、1.5 g/L苦參組.在孔雀石綠被禁用的現(xiàn)實(shí)情況下，這幾種藥可作為防治異齒裂腹魚(yú)魚(yú)卵水霉提供參考依據(jù).