趙芷含， 王馨雅， 王曉婷， 孫冬月， 高 慧

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600）

五味子是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill. 的干燥成熟果實， 具有收斂固澀、 益氣生津、 補腎寧心功效， 主治夢遺滑精、 遺尿尿頻、 久嗽虛喘等癥狀[1］。 傳統(tǒng)中醫(yī)理論記載， 五味子“入嗽藥生用， 入補藥熟用”[2］， 即生熟異用， 但“入補藥熟用” 指的是五味子哪種炮制品尚未見明確記載， 1963 年版《中國藥典》中收錄的是五味子和酒五味子， 而1977 年版及以后幾版變更為五味子和醋五味子。 前期課題組進行藥效實驗， 在一定程度上證明了五味子生熟的差異， 認為治療腎陽虛、 腎陰虛時應(yīng)選酒五味子[3-4］； 本實驗建立大鼠腎精虧虛模型，研究五味子及其炮制品對腎精虧虛大鼠附睪、 腎、 睪丸組織的影響， 為酒五味子“入補藥熟用” 的傳統(tǒng)理論提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 雷公藤多苷片（10 mg／片， 批號Z43020138，湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司）； 血清INH-B 試劑盒（批號BPE30393）、 血清FSH 試劑盒（批號BPE30597） （上海朗頓生物科技有限公司）。 五味子購于遼寧省丹東市五味子GAP 基地， 經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis （Turcz.） Baill. 的干燥成熟果實。

1.2 儀器 數(shù)控超聲波清洗器（KQ-250DB 型， 昆山市超聲儀器有限公司）； 電子分析天平 （萬分之一， Acculab型； 十萬分之一， CP225D 型， 德國Sartorius 公司）； 移液器、 MultiskanMK3 酶標儀（美國Thermo 公司）； 臥式超低溫保存箱（DW-86W100 型， 青島海爾電器有限公司）； 生物顯微鏡（BX51 型）、 光學(xué)顯微鏡（BX60 型） （日本奧林巴斯公司）； 電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-2 型， 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）； 病理組織包埋機； 組織切片機。

1.3 動物 SD 大鼠， 雄性， 體質(zhì)量180～220 g， 由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供， 動物生產(chǎn)許可證號SCXK （遼）2010-0001， 室溫（25 ℃）、 相對濕度50%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 造模藥物 將雷公藤多苷片研磨后， 加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 溶液， 超聲溶解， 即得（3 g／L）。

2.1.2 酒五味子、 醋五味子 參照前期確定的炮制工藝自行制備[5］。

2.1.3 樣品水煎液 取適量生、 酒、 醋五味子， 10 倍量水回流提取3 次， 每次1 h， 合并濾液并濃縮， 即得（280 g／L）。

2.2 造模與給藥 連續(xù)灌胃雷公藤多苷水溶液（10 mg／kg） 30 d[3-4］以建立腎精虧虛大鼠模型， 大鼠皮毛體毛松懈、 少有光澤、 行為遲緩、 精神狀態(tài)不佳、 畏寒聚堆、 體質(zhì)量下降時可認為造模成功。 將大鼠隨機分成模型組、 生五味子組、 酒五味子組、 醋五味子組， 另設(shè)空白對照組， 每組10 只， 給藥組大鼠按2.8 g／kg 劑量灌胃給藥，模型組、 空白組大鼠給予等體積生理鹽水， 連續(xù)30 d， 最后1 次給藥后30 min 處死大鼠， 取出腎臟、 睪丸、 附睪組織進行相關(guān)檢測。

2.3 檢測指標

2.3.1 附睪、 腎組織質(zhì)量 取大鼠新鮮附睪、 腎組織， 精密稱定質(zhì)量。

2.3.2 睪丸組織病理學(xué)檢查 取新鮮大鼠單側(cè)睪丸組織，4%多聚甲醛溶液固定， 常規(guī)石蠟包埋， 蘇木精-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下進行檢查。

2.3.3 血清INH-B、 FSH 水平測定 按試劑盒說明書操作步驟進行測定。

2.3.4 生精細胞病理學(xué)檢查 取大鼠單側(cè)睪丸， Bouins 溶液固定， 酒精脫水， 石蠟包埋， HE 染色， 在光學(xué)顯微鏡下觀察生精細胞凋亡， Cosentino 法對睪丸組織結(jié)構(gòu)進行4 分制評分[正常睪丸組織， 生精上皮排列規(guī)則， 計為1 分；生精上皮排列不規(guī)則， 結(jié)構(gòu)松散（彼此間無黏附）， 緊貼精細小管排列， 計為2 分； 生精上皮排列更加不規(guī)則， 而且有脫落、 缺失， 可見核固縮現(xiàn)象， 精細小管邊界模糊不清， 計為3 分； 緊貼精細小管的生殖細胞出現(xiàn)明顯凝固性壞死， 計為4 分］， Johnson 法[6］評估精子發(fā)生和障礙程度[生精功能正常， 計為10 分； 各階段都存在生精細胞， 但其布列紊亂， 計為9 分； 生精小管中含精子量5 ～10 個，計為8 分； 無精子， 但有許多精子細胞， 計為7 分； 無精子， 僅有少量精子細胞（5 ～10 個）， 計為6 分； 無精子，但有許多精母細胞， 計為5 分； 無精子， 僅有少量精母細胞（＜5 個）， 計為4 分； 僅有精原細胞， 計為3 分； 沒有生精細胞， 只有支持細胞， 計為2 分； 管腔內(nèi)無細胞， 計為1 分］。

2.3.5 生精細胞凋亡率測定 采用原位末端標記法（TUNEL 法）， 嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行， 每張病理切片在光學(xué)顯微鏡下隨機撥取10 個生精小管， 讀取數(shù)量后， 計算生精細胞凋亡率。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理， 數(shù)據(jù)以±s） 表示。 以P＜0.05 為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 五味子對大鼠附睪、 腎組織質(zhì)量的影響 表1 顯示，與模型組比較， 給藥組大鼠附睪、 腎組織質(zhì)量顯著增加（P＜0.01）， 以酒五味子組更明顯（P＜0.01）。

表1 五味子對大鼠附睪、 腎組織質(zhì)量及INH-B、 FSH 水平的影響s， n=10）

表1 五味子對大鼠附睪、 腎組織質(zhì)量及INH-B、 FSH 水平的影響s， n=10）

注：與模型組比較，??P＜0.01；與生五味子組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

空白對照組 — 0.78±0.10?? 0.46±0.05 0.80±0.01?? 0.85±0.09??模型組 — 0.62±0.02 0.28±0.02 0.36±0.03 0.37±0.02生五味子組 2.8 0.69±0.02?? 0.34±0.01?? 0.53±0.02?? 0.44±0.02??酒五味子組 2.8 0.76±0.09??△△ 0.41±0.04??△△ 0.76±0.01??△△ 0.75±0.02??△△醋五味子組 2.8 0.73±0.07??△ 0.37±0.03??△ 0.63±0.02??△△ 0.64±0.03??△△

3.2 五味子對大鼠INH-B、 FSH 水平的影響 表1 顯示，與模型組比較， 給藥組大鼠INH-B、 FSH 水平顯著升高（P＜0.01）， 以酒五味子組更明顯（P＜0.01）。

3.3 五味子對大鼠睪丸組織病理形態(tài)學(xué)的影響 圖1 顯示， 空白對照組大鼠睪丸生精小管呈卵圓形或圓形， 形態(tài)圓而規(guī)則， 含有大量生殖細胞， 精原細胞緊密黏附在精小管的基底膜上， 呈圓形或扁圓形， 生精細胞在不同時期排列整齊， 緊密， 有序， 層次分明； 模型組大鼠睪丸生精小管的生精上皮明顯變薄， 細胞層次雜亂， 一些生精細胞脫落， 并出現(xiàn)輕微聚團現(xiàn)象， 管腔內(nèi)充滿各級生精細胞， 精母、 精原細胞數(shù)減少， 精子細胞、 精子減少量更明顯， 細胞體積明顯縮小， 睪丸間質(zhì)細胞出現(xiàn)輕度腫大， 間質(zhì)細胞減少， 出現(xiàn)較大空隙； 生五味子組大鼠睪丸生精小管呈近橢圓形或圓形， 生精小管含有大量精子， 生精細胞排布較疏松， 細胞層次減少； 酒、 醋五味子組大鼠睪丸生精小管呈卵圓形或圓形， 細胞排布緊密， 并與生精小管基底膜緊密連接， 生精細胞數(shù)略有減少， 部分區(qū)域可見脫落的小量生精細胞， 但結(jié)構(gòu)清楚， 層次較分明。

圖1 五味子對大鼠睪丸組織病理形態(tài)學(xué)的影響（HE 染色， ×200）

3.4 五味子對大鼠生精細胞的影響 圖2 顯示， 空白對照組大鼠生精細胞排列致密緊湊， 數(shù)量較多； 模型組大鼠生精細胞明顯減少， 布列紊亂無序； 生、 酒、 醋五味子組大鼠生精細胞數(shù)目明顯高于模型組， 數(shù)量多， 排列致密緊湊。

圖2 五味子對大鼠生精細胞的影響（HE 染色， ×400）

3.5 五味子對大鼠Cosentino 評分、 Johnson 評分、 凋亡率的影響 表2 顯示， 與模型組比較， 生五味子組大鼠僅Cosentino 評分顯著降低（P＜0.01）， 而酒、 醋五味子組大鼠Cosentino 評分、 凋亡率顯著降低（P＜0.01）， Johnson 評分顯著升高（P＜0.01）， 以酒五味子組更明顯（P＜0.01）。

表2 五味子對大鼠Cosentino 評分、 Johnson 評分、 凋亡率的影響s， n=10）

表2 五味子對大鼠Cosentino 評分、 Johnson 評分、 凋亡率的影響s， n=10）

注：與模型組比較，??P＜0.01；與生五味子組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

空白對照組 — 1.01±0.01?? 9.78±0.21?? 10.51±4.09??模型組 — 3.31±0.16 8.36±0.35 31.37±6.02生五味子組 2.8 2.00±0.07?? 8.53±0.42 25.44±8.72酒五味子組 2.8 1.35±0.09??△△ 9.56±0.81??△△ 15.75±5.06??△△醋五味子組 2.8 1.84±0.15??△ 9.23±0.62??△ 20.64±4.73??△

4 討論

抑制素B （INH-B） 參與精子發(fā)生， 對預(yù)測不育患者無精子癥和精子獲得率具有重要意義， 它主要由睪丸支持細胞合成， 是評估精子發(fā)生的直接有效內(nèi)分泌指標[7］， 當(dāng)睪丸生精功能受損時， 血清中其水平有所降低[8］； 卵泡刺激素（FSH） 也稱為精子生成素[9］， 主要作用于睪丸支持細胞， 促進睪丸曲細精管精子生成[9］， 在支持細胞增殖、分化、 成熟、 分泌中起著關(guān)鍵作用， 當(dāng)它與支持細胞膜上其受體結(jié)合后， 可使支持細胞內(nèi)環(huán)腺嘌呤核苷酸（cAMP）水平升高， 從而促使其合成并分泌多種物質(zhì)[10］， 可直接或者間接介入生精細胞的發(fā)育成熟， 促進睪丸曲精管生產(chǎn)精子。 另外， 精子本身在發(fā)生過程中就存在生精細胞凋亡現(xiàn)象， 機體可通過凋亡來維持精子數(shù)量動態(tài)平衡， 在一些特殊情況下可誘導(dǎo)生殖細胞凋亡增長[10-11］， 一旦生精細胞過度凋亡， 將會影響精子產(chǎn)生量， 導(dǎo)致各種生精阻滯。

雷公藤多苷等多種藥物和化學(xué)毒物對支持細胞有生殖毒性作用， 可損害生精功能[11-14］。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 腎精虧虛模型大鼠附睪、 腎組織質(zhì)量明顯減少， 而給藥后其質(zhì)量明顯增加， 其中酒、 醋五味子效果優(yōu)于生五味子， 又以前者更強； 模型大鼠血清INH-B、 FSH 水平及生精功能明顯下降， 而給藥后可明顯改善兩者水平， 減少生精細胞脫落，從而提高大鼠生精功能， 其中酒、 醋五味子效果優(yōu)于生五味子， 又以前者更強。

綜上所述， 五味子炮制后能增強對腎精虧虛大鼠的治療作用， 以酒五味子更明顯， 故臨床上“入補藥熟用” 時宜選用該炮制品。