常景芝， 蔣建平， 李宜川， 劉國玲， 郭 輝， 劉 青， 蘆 琨， 劉 嘉，關(guān)紅亞

（1. 商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 河南 商丘 476100； 2. 鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院， 河南 鄭州 450000）

糖尿病腎病是糖尿病引起的微血管并發(fā)癥之一， 危害性大， 致死率高， 糖尿病腎病腎小球系膜細胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1 （GLUT-1） 的高度表達被認為是其重要發(fā)病機制[1］。 研究表明， 高糖可通過激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 MAPK）， 促進系膜細胞增殖， 從而增加下游結(jié)締組織生長因子（CTGF） 合成[2-4］， 后者可促進成纖維細胞增生， 與許多組織器官的纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5］。 鐵皮楓斗Dendrobium candicum Wall. ex Lindl. 為鐵皮石斛加工后的干品， 其主要成分為石斛多糖、 石斛堿、 總氨基酸等， 具有益胃生津、 滋陰清熱等藥理作用[6］。 本實驗擬通過建立糖尿病大鼠模型， 探討鐵皮楓斗顆粒對其腎臟的保護作用及機制。

1 材料

1.1 藥物 鐵皮楓斗顆粒購自浙江天皇藥業(yè)有限公司， 批號1501063； 厄貝沙坦購自賽諾菲（杭州） 制藥有限公司，批號1411027。

1.2 動物 健康雄性大鼠70 只， 體質(zhì)量200～220 g， 購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心， 動物生產(chǎn)許可證號SCXK（晉） 20150001。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素 （批號SLBB7534V） 購自美國Sigma 公 司； 血 肌 酐 （批 號1310024）、 尿 素 氮 （批 號14021217）、 血 糖 （ 批 號 1407049）、 尿 蛋 白 （ 批 號1408067） 檢測試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司； 血管內(nèi)皮生長因子ELISA 檢測試劑盒（批號1403045）購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司； GLUT-1 （批號SP0023）、 CTGF （批號SP0022） 免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司； 兔抗GLUT-1 （批號BS0472R）、兔抗CTGF （批號BS0472R） 購自英國Abcam 公司； 逆轉(zhuǎn)錄 試 劑 盒 （ 批 號 00264978）、 PCR 試 劑 盒 （ 批 號00392278） 購自美國Thermo Scientific 公司； PCR 引物（批號HB1411099005） 購自上海生工生物工程有限公司。

1.4 儀器 日立7600 型全自動生化分析儀（日本日立公司）； 羅氏Accu-Chek 血糖測定儀（瑞士羅氏公司）； Bio-Rad 500 型酶標儀（美國Bio-Rad 公司）； ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

2 方法

2.1 建模及分組 大鼠隨機分為正常組（12 只） 和造模組（70 只）， 造模組大鼠腹腔注射l%鏈脲佐菌素（60 mg／kg），對照組大鼠腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液（0.1 mol／L），72 h 后尾靜脈采血， 測定血糖濃度， ≥16.7 mmol／L 時為建模成功。 造模組大鼠隨機分為模型組、 厄貝沙坦組（17.5 mg／kg）、 鐵皮楓斗顆粒組， 其中最后一組根據(jù)臨床每天服用劑量和文獻[7］ 又分為低劑量（0.2 g／kg）、 中劑量（0.4 g／kg）、 高劑量（0.8 g／kg）， 給藥組大鼠每天灌胃1 次， 連續(xù)8 周， 正常組、 模型組大鼠給予等體積生理鹽水。

2.2 標本收集 在第4、 8 周， 稱定大鼠體質(zhì)量， 尾靜脈采血， 測定血糖濃度， 并收集24 h 尿液用于測定24 h 尿蛋白； 在第8 周末， 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后靜脈取血，分離血清， -20 ℃下保存， 用于測定血肌酐、 尿素氮。 取大鼠雙腎， 充分灌洗后稱定質(zhì)量， 右腎取一部分腎皮質(zhì)，固定于4%聚甲醛中， 剩余部分置于液氮中保存待用。

2.3 生化指標檢測 血糖儀測定血糖， 自動生化分析儀測定血肌酐、 尿素氮、 24 h 尿蛋白， 雙抗體夾心ELISA 法測定血管內(nèi)皮生長因子。 腎質(zhì)量指數(shù)=右腎質(zhì)量／體質(zhì)量。

2.4 大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1、 CTGF 表達檢測 免疫組化采用SP 法。 按照標準步驟， 分別加入GLUT1 一抗（1 ∶200）、CTGF 一抗（1 ∶100） 孵育， 再加入二抗， 顯色并復(fù)染，設(shè)置陽性、 陰性對照。 高倍顯微鏡下（×400） 每張切片隨機選取5 個不同的視野， 測定光密度值， 取平均值。

2.5 腎臟病理學(xué)檢測 取石蠟包埋的大鼠腎皮質(zhì)， 按照標準步驟切片， 常規(guī)HE 染色， 光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)學(xué)變化。

2.6 大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1、 CTGF 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。 取腎組織裂解， 勻漿， 測定上清蛋白濃度， 6% SDS-PAGE 電泳、 轉(zhuǎn)膜、 封閉后， 分別加入GLUT-1 一抗、 CTGF 一抗， 4 ℃下孵育過夜， 洗滌液（TBST） 洗滌3 次后， 加入用HRP 標記的二抗， 室溫下封閉2 h， 再加入TBST 洗滌3 次， 每次10 min， 按照蛋白檢測說明書，采用ECL 發(fā)光法檢測蛋白。

2.7 大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1、 CTGF mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。 Trizol 法抽取總RNA 后， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 在實時熒光定量PCR 儀上進行定量分析。 以GAPDH 為 內(nèi) 參， GLUT-1 正 向5′-TCTGGCATCAACGCTGTCTTC-3′， 反向5′-CGATACCGGAGCCAATGGT-3′； CTGF 正向5′-TAGCTGCCTACCGACTGGAA-3′， 反向5′-CTAGAACAGGCGCTCCACT-3′； GAPDH 正 向5′-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3′， 反 向 5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′， 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃15 s，60 ℃退火30 s， 40 個循環(huán)， 72 ℃終末延伸5 min。 再應(yīng)用2-△△Ct法對結(jié)果進行分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理， 作圖選擇GraphPad Prism 軟件， 計量數(shù)據(jù)以表示， 非正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行分析， 2 組間比較采用t 檢驗， 多組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 常規(guī)指標 表1 顯示， 在第4、 8 周， 模型組、 鐵皮楓斗顆粒組、 厄貝沙坦組大鼠血糖濃度顯著高于正常組（P＜0.01）， 但各組之間無顯著差異（P＞0.05）。 模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于正常組（P＜0.01）， 而鐵皮楓斗顆粒組（第8 周低劑量組除外）、 厄貝沙坦組顯著高于模型組（P＜0.05）。 與正常組比較， 模型組大鼠腎重指數(shù)顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較， 鐵皮楓斗顆粒組、 厄貝沙坦組大鼠腎重指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組大鼠常規(guī)指標比較

表1 各組大鼠常規(guī)指標比較

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

正常組 12 — 6.43±0.65 6.39±0.61 362.29±12.90 451.79±21.05 3.82±0.42模型組 12 — 23.34±1.77## 27.56±2.09## 315.30±6.80## 305.35±8.55## 10.24±1.03##鐵皮楓斗顆粒低劑量組 11 0.2 22.74±1.59## 27.34±2.31## 321.10±7.14? 312.08±9.19 7.52±0.69??鐵皮楓斗顆粒中劑量組 12 0.4 22.48±1.55## 26.79±2.27## 322.41±8.04? 313.25±8.54? 6.32±0.54??鐵皮楓斗顆粒高劑量組 12 0.8 22.25±1.55## 26.63±2.45## 324.15±9.23? 316.15±9.23? 5.97±0.48??厄貝沙坦組 11 17.5 mg／kg 22.85±1.69## 26.94±2.17## 322.82±8.13? 314.33±8.87? 6.04±0.52??

3.2 生化指標 表2、 圖1 顯示， 與正常組比較， 模型組、鐵皮楓斗顆粒組、 厄貝沙坦組大鼠血肌酐、 尿素氮、 24 h尿蛋白、 血管內(nèi)皮生長因子顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 鐵皮楓斗顆粒組、 厄貝沙坦組上述生化指標顯著下降（P＜0.05， P＜0.01）， 其中鐵皮楓斗顆粒組呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠生化指標比較（

表2 各組大鼠生化指標比較（

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 動物數(shù)／只劑量／（g·kg-1）血肌酐／（μmol·L-1）尿素氮／（mmol·L-1）24 h 尿蛋白／（mg·d-1）血管內(nèi)皮生長因子／（μg·L-1）正常組 12 — 42.77±5.62 7.41±0.76 7.56±0.81 27.05±4.52模型組 12 — 79.63±4.25## 13.84±1.19## 26.29±6.53## 89.54±10.27##鐵皮楓斗顆粒低劑量組 11 0.2 72.17±8.25? 12.79±0.94? 18.28±2.60?? 65.34±7.52??鐵皮楓斗顆粒中劑量組 12 0.4 69.73±7.75? 12.13±0.87? 17.16±2.56?? 62.14±6.94??鐵皮楓斗顆粒高劑量組 12 0.8 65.79±6.36? 11.62±1.12?? 16.20±3.25?? 58.41±6.87??厄貝沙坦組 11 1.75×10-4 68.85±7.34? 11.79±0.92? 16.91±2.72?? 60.23±7.02??

3.3 腎臟病理變化 圖2 顯示， 正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)無明顯病理變化； 模型組大鼠腎臟有病理變化， 表現(xiàn)為腎小球肥大、 系膜結(jié)構(gòu)改變； 鐵皮楓斗顆粒組、 厄貝沙坦組上述現(xiàn)象明顯減輕， 其中鐵皮楓斗顆粒組呈劑量依賴性。

3.4 大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1、 CTGF 表達 圖3～5 顯示， 與正常組比較， 模型組大鼠腎組織著色廣泛、 濃集， GLUT-1、CTGF 表達顯著增高（P＜0.01）； 與模型組比較， 鐵皮楓斗顆粒組、 厄貝沙坦組大鼠腎組織著色范圍相似， 但程度明顯減輕， GLUT-1、 CTGF 表達顯著下降（P＜0.01）， 其中鐵皮楓斗顆粒組呈劑量依賴性。

圖1 不同劑量鐵皮楓斗顆粒對大鼠血肌酐（A）、 尿素氮（B）、 24 h 尿蛋白（C）、 血管內(nèi)皮生長因子（D） 的影響

圖2 各組大鼠腎臟病理變化（×400）

圖3 各組大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1 表達（×400）

3.5 大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1、 CTGF 蛋白表達 圖6 顯示， 與正常組比較， 模型組GLUT-1、 CTGF 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 鐵皮楓斗顆粒組、 厄貝沙坦組兩者表達顯著降低（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠腎皮質(zhì)CTGF 表達（×400）

圖5 各組大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1 （A）、 CTGF （B） 表達

3.6 大鼠腎皮質(zhì)組織GLUT-1、 CTGF mRNA 的表達 圖7顯示， 與正常組比較， 模型組GLUT-1、 CTGF mRNA 表達顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 鐵皮楓斗顆粒組、厄貝沙坦組兩者表達顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）。

圖6 各組大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1 （A）、 CTGF （B） 蛋白表達

4 討論

高糖環(huán)境可導(dǎo)致組織局部缺氧， 缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1） 表達增加， 進而導(dǎo)致VEGF 表達上調(diào)， 被認為是糖尿病腎病的發(fā)病機制之一[8］。 本實驗發(fā)現(xiàn)， 鐵皮楓斗顆粒能顯著降低大鼠血清中VEGF 表達， 并呈劑量依賴性。前期報道， 鐵皮楓斗具有耐缺氧活性， 對糖尿病血管病變具有一定保護作用[9］； 本實驗結(jié)果提示， 鐵皮楓斗顆?？赡芡ㄟ^提高缺氧耐受來降低HIF-1 表達， 干擾大鼠體內(nèi)VEGF 表達， 從而延緩糖尿病腎病進程， 發(fā)揮保護腎臟的作用。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白是調(diào)控細胞內(nèi)糖攝入及糖代謝的第一道關(guān)卡， 在介導(dǎo)糖尿病組織損傷中起著重要作用。 GLUT-1是GLUT 最主要的亞型， 其高表達可提高腎小球?qū)ζ咸烟堑奈眨?增加糖尿病腎病風(fēng)險。 受到各種胞外信號刺激后，P38 MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細胞內(nèi)信號傳遞的共同通路[4，10］， 而高糖可通過激活P38 MAPK 來增加下游轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 合成， 并且CTGF 在TGF-β 致纖維化過程中也發(fā)揮著重要作用[11］。 前期研究顯示， 腎小球、 腎小管、腎間質(zhì)纖維化在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[12］； 本實驗通過免疫組化、 Western blot、 RT-PCR 法檢測大鼠腎皮質(zhì)中GLUT-1、 CTGF 蛋白、 mRNA 表達， 發(fā)現(xiàn)與模型組比較， 鐵皮楓斗顆粒組其表達量顯著降低， 并呈劑量依賴性。 由此可知， 鐵皮楓斗顆粒能有效減少GLUT-1表達， 盡管對大鼠血糖濃度無明顯影響， 但對糖尿病腎病進展具有抑制作用， 它對GLUT-1 表達的影響及耐缺氧活性可減少胞外信號刺激， 干擾P38 MAPK-CTGF 通路激活，從而減少下游TGF-β、 CTGF 表達。

圖7 各組大鼠腎皮質(zhì)GLUT-1 （A）、 CTGF （B）mRNA 表達

鐵皮楓斗顆粒治療8 周后， 腎重指數(shù)、 血肌酐、 尿素氮、 24 h 尿蛋白等腎功能相關(guān)指標明顯改善。 同時， 腎臟病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)該制劑能有效延緩大鼠腎病進展， 并呈劑量依賴性。

綜上所述， 鐵皮楓斗顆粒對糖尿病大鼠腎臟有保護作用， 其機制可能與調(diào)節(jié)VEGF、 GLUT-1、 CTGF 表達來延緩糖尿病腎病進展有關(guān)。