王 敏， 布 仁， 陳建平， 李鑫雨， 巴俊杰

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

烏蘭三味湯散， 蒙文名又稱瑪日布-3 湯散、 烏蘭-3等， 出自《蒙醫(yī)成方選》， 目前收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》蒙藥分冊[1］。 該方由紫草茸、 茜草、 枇杷葉三味藥材組成，劑型為湯散劑， 有清血熱之功效， 用于治療肺熱咳嗽， 肺、腎損傷性熱， 痰中帶血， 尿頻尿痛， 膀胱刺痛， 以紫草茸為主， 可清血熱及肺、 腎熱， 茜草、 枇杷葉為伍， 輔以清血熱， 全方性涼， 為清肺腎熱之良方[2］。 周桂坤[3］和李麗[4］分別采用HPLC 法測定了其中大葉茜草素和茜草素的含有量， 嘎魯?shù)萚5］測定了微量元素， 原標(biāo)準(zhǔn)有制法、 處方、性狀、 功效， 規(guī)格、 用法、 用量及貯藏條件[1］。 本研究對該蒙藥進(jìn)行了顯微和薄層色譜鑒別， 并用HPLC 法測定了熊果酸的含有量， 這對完善和提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控水平有著重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-8A 高效液相色譜儀 （日本島津公司）；AB135-S 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； 奧林巴斯pd25 攝像采集器； KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（金壇市江南儀器廠）； bx41 數(shù)碼顯微鏡； SLD-Ⅰ型薄層色譜攝像儀（天津思利達(dá)色譜技術(shù)開發(fā)公司）； SHZ-CA 型循環(huán)多用真空泵（昆山市超聲儀器有限公司）； HH-2 恒溫水浴鍋（鞏義市英峪儀器廠）； ZDZ-6 型紫外分析儀（上海信誼儀器廠）； 薄層展開槽（上海安亭電子儀器廠）。

1.2 材料 烏蘭三味湯散（內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司、 內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中心和內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥重點實驗室）。 紫草茸、 茜草、 枇杷葉經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥用植物教研室渠弼副教授鑒定為正品，均由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中心提供。 紫草茸、茜草、 枇杷葉對照藥材（中國食品藥品檢定研究院， 批號分別 為121052-201302、 121049-201404、 201261-201303）。大葉茜草素、 熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110884-2-1405、 110742-201421）。 甲醇和乙腈為色譜純； 其他試劑為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 茜草為根類藥材， 枇杷葉為葉類藥材， 紫草茸為樹膠類藥材， 顯微特征差別較大， 均具有不受干擾的專屬性特征， 并易于察見。 將混合粉末制片后（水裝片、 水合氯醛透化片、 染色片等）， 置于顯微鏡下觀察。

2.1.1 紫草茸 將本品粉末制片后在顯微鏡下觀察， 可見黃棕色或紅棕色不規(guī)則半透明塊狀或顆粒狀物， 為紫草茸的顯微特征[6］。

2.1.2 茜草 將本品粉末制片后在顯微鏡下觀察， 可見導(dǎo)管為具緣紋孔導(dǎo)管， 其薄壁細(xì)胞含紅棕色顆粒， 草酸鈣針晶存在于薄壁細(xì)胞中或散在， 為茜草的顯微特征[7］。

2.1.3 枇杷葉 將本品粉末制片后在顯微鏡下觀察， 可見纖維周圍薄壁細(xì)胞含方晶， 且形成晶纖維， 形狀為非腺毛彎曲或呈人字形， 草酸鈣簇晶直徑為40 ～110 μm， 為枇杷葉的顯微特征。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 紫草茸 參照文獻(xiàn)[8］ 和2015 年版《中國藥典》四部通則0502 薄層色譜法[9］， 稱取本品1.5 g、 紫草茸對照藥材0.5 g、 紫草茸陰性本品1.0 g， 制備供試品溶液、對照藥材溶液、 陰性對照溶液， 點樣量都為6 μL， 薄層板為硅膠G 板， 展開劑為氯仿-甲苯-丙酮-甲酸（5.0 ∶5.0 ∶0.8 ∶0.2）。 經(jīng)點樣、 飽和、 展開和熱風(fēng)吹干后， 在薄層色譜上于365 nm 紫外燈下檢視， 供試品在與對照藥材相對應(yīng)的位置顯示多個相同顏色的熒光斑點， 而陰性對照品色譜

上無干擾斑點， 見圖1。

圖1 紫草茸薄層鑒別

2.2.2 茜草 參照2015 年版《中國藥典》 一部茜草項下薄層色譜鑒別[10］、 文獻(xiàn)[11］ 和2015 年版《中國藥典》四部通則0502 薄層色譜法[9］， 稱取本品1.5 g、 茜草對照藥材0.5 g、 茜草陰性本品1.0 g， 制備供試品溶液、 對照藥材溶液、 陰性對照溶液。 另取大葉茜草素對照品， 用甲醇溶解制成每1 mL 含2.5 mg 該成分的溶液， 作為對照品溶液， 點樣量都為5 μL， 薄層板為硅膠G 板， 展開劑為石油醚（60～90 ℃） -丙酮（4 ∶1）。 經(jīng)點樣、 飽和、 展開和熱風(fēng)吹干后， 于365 nm 紫外燈下檢視， 供試品在與對照藥材相對應(yīng)的位置顯示多個相同顏色的熒光斑點， 在與對照品相對應(yīng)的位置顯示相同的藍(lán)色熒光斑點， 而陰性對照品色譜上無干擾斑點， 見圖2。

圖2 茜草薄層鑒別

2.2.3 枇杷葉 參照2015 年版《中國藥典》 一部枇杷葉項下薄層色譜鑒別[12］、 文獻(xiàn)[13］ 和2015 年版《中國藥典》 四部通則0502 薄層色譜法[9］， 取本品3 g、 枇杷葉對照藥材1 g、 枇杷葉陰性本品2 g， 制備供試品溶液、 對照藥材溶液、 陰性對照溶液。 另取熊果酸對照品， 用甲醇溶解制成每1 mL 含1 mg 該成分， 作為對照品溶液， 點樣量都為3 μL， 薄層板為硅膠G 板， 展開劑為甲苯-丙酮（5 ∶1）， 顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。 經(jīng)點樣、 飽和、 展開、 顯色和熱風(fēng)吹干后， 供試品在與對照藥材相對應(yīng)的位置顯示2 個相同顏色的斑點， 在與對照品相對應(yīng)的位置顯示相同顏色的斑點， 而陰性對照品色譜無干擾斑點， 見圖3。

2.3 HPLC 法測定熊果酸含有量

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取熊果酸對照品適量， 加甲醇溶解制成0.70 mg／mL 溶液， 即得。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取烏蘭三味湯散3.0 g，置于25 mL 量瓶中， 精密加入氯仿20 mL， 稱定質(zhì)量， 超聲20 min， 間歇10 min， 繼續(xù)超聲20 min， 冷卻至室溫后再稱定質(zhì)量， 減少的質(zhì)量用氯仿補(bǔ)足， 搖勻， 過濾， 取濾液5 mL， 在水浴鍋上蒸干， 甲醇復(fù)溶， 定容至5 mL 量瓶中， 即得（進(jìn)樣時用0.45 μm 微孔濾膜過濾）。

2.3.3 色譜條件 ODS-2 Hypersil 柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈-甲醇-水-乙酸銨（60 ∶14 ∶30 ∶0.6）；體積流量1 mL／min； 柱溫25 ℃； 檢測波長215 nm。 該色譜條件下， 熊果酸色譜峰與其他組分色譜峰分離度良好，見圖4。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1” 項下熊果酸對照品溶液0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL， 分別置于1 mL 量瓶中， 甲醇定容， 搖勻， 得到質(zhì)量濃度分別為0.140 8、0.281 6、 0.422 4、 0.563 2、 0.704 0 mg／mL 溶 液， 在“2.3.3” 項色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL 測定其峰面積。 以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 得回歸方程為Y=5×106X＋209 839 （r=0.999 3），在0.140 8～0.704 0 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取“2.3.1” 項下對照品溶液20 μL， 在“2.3.3” 項色譜條件下測定， 重復(fù)5 次， 測得峰面積RSD 為0.71%， 表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取本品（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥重點實驗室） 5 份， 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3.3” 項色譜條件下測定， 測得熊果酸含有量RSD 為2.9%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.2” 項下供試品溶液， 在“2.3.3” 項色譜條件下于0、 2、 4、 6、 8 h 測定， 測得峰面積RSD 為1.56%， 表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取本品（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥重點實驗室） 6 份， 每份約1.5 g， 精密稱定， 1、 2 號樣品加入原含有量50%熊果酸對照品， 3、 4 號樣品加入原含有量100%熊果酸對照品， 5、 6 號樣品加入原含有量150%熊果酸對照品， 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3.3” 項色譜條件下測定。 結(jié)果， 平均加樣回收率為100.1%， RSD 為1.7%， 見表1。

圖4 熊果酸HPLC 色譜圖

表1 熊果酸加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.3.9 樣品含有量測定 取3 種不同來源的本品， 每種3份， 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3.3”項色譜條件下測定， 結(jié)果見表2。

表2 熊果酸含有量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 顯色劑篩選 文獻(xiàn)報道可用10%香草醛硫酸溶液[12］，但本實驗發(fā)現(xiàn)顯色效果不好， 層析斑點模糊不清。 再用10%硫酸乙醇作為顯色劑， 顯色效果較好， 得到了斑點清晰的薄層色譜。

3.2 流動相篩選 根據(jù)文獻(xiàn)[13-14］， 首先選擇的流動相分別為乙腈-甲醇-水（60 ∶14 ∶27） 和乙腈-甲醇-水-醋酸銨（60 ∶14 ∶28 ∶0.6）， 結(jié)果表明醋酸銨的存在對分離熊果酸和齊墩果酸至關(guān)重要， 能較好地分離兩者。 經(jīng)反復(fù)實驗， 最終確定流動相為乙腈-甲醇-水-醋酸銨（60 ∶14 ∶30 ∶0.6），既可確保柱效的穩(wěn)定性， 又能達(dá)到較好的分離效果。

3.3 保留時間考察 文獻(xiàn)報道的保留時間是17 min[15］，但本實驗發(fā)現(xiàn)此時熊果酸、 齊墩果酸分離效果不理想， 故將其延長至21 min， 從而使兩者得到了較好的分離。