何 平， 郭曄紅， 李 欠， 吳繼宇

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 中草藥栽培與鑒定系／中藥材研究所， 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室， 甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室， 甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心， 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070）

忍冬科、 忍冬屬植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾（金銀花， 又名忍冬） 和莖枝（忍冬藤） 均可入藥， 兩者具有清熱解毒的功效[1］， 主產(chǎn)于山東、 河南， 全國大部地區(qū)均有栽培。 國內(nèi)外研究人員對金銀花的化學(xué)成分及藥理作用作了大量研究， 結(jié)果表明其中富含揮發(fā)油、 有機酸、 黃酮、 環(huán)烯醚萜類等， 廣泛應(yīng)用于治療各種疾病， 包括發(fā)燒、 感染、 腫脹等[2-3］。 另外， 金銀花提取物具有廣泛的生物活性， 如抗菌、 抗炎、 解熱、 抗病毒、 抗氧化等作用[4-6］。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， 在不同品種的金銀花中均可檢測到花青素[7］， 它屬類黃酮化合物， 為普遍存在于植物中的水溶性天然色素， 是花、 莖和葉顏色的主要呈色物質(zhì)， 同時也是具有較高抗氧化能力的次級代謝物[8］， 因其抗氧化、 抗炎和抗腫瘤等作用而被廣泛研究[9-10］。

忍冬葉作為非藥用部分， 長期以來未得到充分利用， 導(dǎo)致大量資源浪費。 研究表明， 忍冬葉中有機酸、 黃酮等成分均具有良好的抗氧化作用， 其中葉片中黃酮含有量明顯高于花蕾和莖枝中[11-13］。目前對金銀花中花青素的研究較為集中， 但對其莖枝、 葉片中該成分的檢測還未見報道， 故本實驗采用HPLC 法檢測“亞特紅” “亞特青蕾” 金銀花和忍冬3 個地上器官中綠原酸、 木犀草苷、 花青素的含有量， 為擴大西北地區(qū)忍冬屬植物資源， 改善西北地區(qū)生態(tài)環(huán)境， 有效利用金銀花葉片提供理論依據(jù)。

1 材料

日立L-2000 型高效液相色譜儀（天美科技有限公司）； AL104 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； 萬能粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）； 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）； LT-250 型超聲波藥品處理機（濟寧魯通超聲電子設(shè)備有限公司）； 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

乙腈、 甲醇、 磷酸均為色譜純； 鹽酸、 甲醇均為分析純； 超純水過濾。 對照品綠原酸 （批號GR133151019， 南京廣潤生物制品公司）； 木犀草苷（GR133151228， 南京廣潤生物制品公司）； 矢車菊-3-O-葡萄糖苷（批號LB30Q125， 北京百靈威公司）。 因矢車菊-3-O-葡萄糖苷是較為常見的花青素[14］， 故本實驗選用其作為對照。

“亞特紅” 金銀花Lonicera japonica Yatehong LSB 用YTH 表示， 良種編號國S-SV-LJ-023-2010魯S-SV-LJ-002-2004； “亞特青蕾” 金銀花Lonicera japonica Yateqinglei LSB 用QL 表示， 良種編號魯SSV-LJ-003-2004[15］； 以忍冬Lonicera japonica Thunb.作對照， 用cK 表示， 具體見表1。 “亞特” 金銀花品種購自山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司， 忍冬由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)郭曄紅副教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 綠原酸、 木犀草苷分析采用LaChrom C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B）， 梯度洗脫（0 ～5 min， 86% B； 5 ～15 min， 86% ～72% B； 15 ～27 min， 72% ～75%B； 27～30 min， 75% ～86%B）；體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長綠原酸327 nm、 木犀草苷350 nm。

矢車菊-3-O-葡萄糖苷分析采用LaChrom C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸 （B）， 梯度洗脫 （0 min， 10%A； 25 min， 25% A； 25.1 min， 10% A； 30 min，10% A[16］）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫40 ℃；檢測波長525 nm； 進樣體積20 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品綠原酸、木犀草苷10 mg 和矢車菊-3-O-葡萄糖苷5 mg， 綠原酸與木犀草苷用50% 甲醇溶液溶解并定容至10 mL， 矢車菊-3-O-葡萄糖苷用5% HCL-甲醇溶解并定容至10 mL， 充分搖勻， 配制成1.05、 1.03、0.50 mg／mL， 即得， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液制備 將“亞特紅” “亞特青蕾”金銀花和忍冬的花、 葉、 莖枝干燥后， 用萬能粉碎機粉碎（過4 號篩）， 精密稱取1.0、 0.1 g， 分別用50% 甲醇、 10 mL 5% HCl-甲醇溶液浸泡10 h，25 ℃超聲30 min， 補足至25、 10 mL， 提取液用0.22 μm 濾膜過濾到1.5 mL 棕色小瓶中， 即得。

2.4 線性關(guān)系考察 見表2。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.2” 項下花青素對照品溶液， 在“2.2” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 次， 每次20 μL， 測得花青素的峰面積RSD 2.18%， 表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同1 樣品提取液， 將樣品放置0、 2、 4、 6、 8、 10 h 后， 在“2.2” 項色譜條件下進樣， 測得綠原酸、 木犀草苷、 矢車菊-3-O-葡萄糖苷保留時間RSD 分別為0.59%、 0.26%、1.94%， 表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 向含有量已知的供試品中添加花青素對照品溶液， 分別按樣品溶液中已知含有量的80%、 100%、 120% 加入， 作為3 個水平，每個水平重復(fù)3 次， 在“2.2” 項色譜條件下進樣， 計算回收率。 結(jié)果， 花青素平均加樣回收率為100.49%。

2.8 樣品含有量測定 取不同品種、 器官樣品，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.2”項色譜條件下進樣， 色譜圖見圖1。

3 分析與討論

3.1 綠原酸含有量差異 圖2 表明， 3 個品種金銀花中綠原酸成分含有量分布規(guī)律為第1 茬花＞莖枝＞第2 茬花＞葉片， 品種之間含有量比較規(guī)律為“亞特紅” 金銀花＞ “亞特青蕾” 金銀花＞忍冬。綠原酸是2015 版《中國藥典》 中規(guī)定的指標(biāo)成分， 在金銀花干燥品中含有量不得低于1.50%，經(jīng)測定， 花中其含有量平均值全部高于2.50%，符合入藥標(biāo)準(zhǔn)。 另外， 各品種中第2 茬金銀花的含有量均低于第1 茬， 忍冬、 “亞特紅” 和“亞特青蕾” 的第1 茬金銀花分別是第2 茬的1.33、 1.40、1.28 倍， 表明第1 茬（5 月采收） 質(zhì)量較好。 各品種金銀花莖枝中綠原酸平均含有量分別為2.63%、 3.79%、 3.00%， 葉片中分別為1.43%、2.34%、 1.70%， 表明除忍冬葉片略低外， 其他樣品均高于《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 3 個品種金銀花不同器官綠原酸含有量Fig.2 Chlorogenic acid content in different organs of three cultivars of L． japonica

3.2 木犀草苷含有量差異 2015 版《中國藥典》中規(guī)定金銀花中木犀草苷按干燥品計算含有量不得少于0.050%。 圖3 表明， 忍冬和“亞特青蕾” 金銀花中木犀草苷含有量分布為莖枝＞葉片＞第1 茬花＞第2 茬花， “亞特紅” 金銀花中為葉片＞莖枝＞第1 茬花＞第2 茬花； 各品種間為“亞特紅” ＞“亞特青蕾” ＞忍冬， 而且3 個地上器官中其含有量均高于《中國藥典》 要求， 符合入藥標(biāo)準(zhǔn)。 其中， 忍冬、 “亞特紅” 金銀花、 “亞特青蕾” 金銀花的葉片含有量分別是第1 茬花的1.40、 2.87、2.10 倍， 莖 枝 分 別 是 第1 茬 花 的1.30、 1.76、2.56 倍， 表明葉片中含有較多的木犀草苷。

圖3 3 個品種金銀花不同器官木犀草苷含有量Fig.3 Luteoloside content in different organs of three cultivars of L． japonica

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

3.3 花青素含有量差異 圖4 表明， 3 個品種金銀花中花青素含有量分布規(guī)律均為葉片＞莖枝＞第1茬花＞第2 茬花； 在同一器官中， 3 個品種中為“亞特紅” 金銀花＞忍冬＞ “亞特青蕾” 金銀花。在3 個品種中， “亞特紅” 金銀花中花青素含有量最高， 與忍冬和“亞特青蕾” 金銀花的含有量差異達極顯著水平（P＜0.01）， 第1 茬、 第2 茬、 莖枝、 葉 片 含 有 量 依 次 為 0.69、 0.57、 0.80、1.79 mg／g， 葉片含有量是第1 茬花的2.59 倍、 第2 茬花的3.14 倍、 莖枝的2.24 倍， 葉片與第1、 2茬花、 莖枝差異極顯著（P＜0.01）。 “亞特青蕾”金銀花中含有量最低， 與忍冬含有量差異不大， 表明在“亞特青蕾” 金銀花與忍冬的不同地上器官中含極少量的花青素。 “亞特青蕾” 金銀花與忍冬的3 個地上器官呈綠色或青綠色， 而“亞特紅”金銀花花蕾與新嫩莖枝呈紫紅色， 葉片正面呈深綠色， 葉背呈明顯的紫紅色， 也可判斷出“亞特紅”金銀花中花青素含有量最高。

圖4 3 種金銀花不同器官花青素含有量Fig.4 Anthocyanin content in different organs of three cultivars of L． japonica

3.4 有效成分比例 表3 表明， 3 個品種金銀花不同地上器官之間有效成分含有量差異較大， 在忍冬中， 綠原酸與木犀草苷比例在第2 茬花中最高，達41.00 ∶1， 葉片最低， 為10.21 ∶1； 綠原酸與花青素比例第2 茬花最多， 達351.43 ∶1， 同樣也是葉片比例最低， 為40.86 ∶1。 在“亞特紅” 金銀花中， 綠原酸與木犀草苷比例與忍冬一致， 第2茬花中最高， 達35.43 ∶1， 葉片最低， 為8.85 ∶1；綠原酸與花青素比例規(guī)律也與忍冬相同， 第1 茬花中最多， 葉片中最少。 在“亞特青蕾” 金銀花中，綠原酸與木犀草苷、 綠原酸與花青素比例規(guī)律與前2 個品種一致。 在3 個品種金銀花中， 3 種成分的比例規(guī)律均為第2 茬花＞第1 茬花＞莖枝＞葉片。

表3 3 個品種金銀花不同器官有效成分比例Tab.3 Proportions of active ingredients in different organs of three cultivars of L． japonica

4 討論

目前《中國藥典》 規(guī)定， 金銀花入藥部位包括花及莖枝， 入藥后分別為金銀花和忍冬藤， 有研究強調(diào)， 金銀花植株不同器官中均含不同程度的藥效成分[17］。 通過對第1、 2 茬花、 莖枝和葉片中綠原酸、 木犀草苷、 花青素含有量的測定發(fā)現(xiàn)， 第1茬花3 種成分含有量均高于第2 茬花， 其原因是第1 茬花成花前處于緩苗階段， 并且在5 月份陽光充足， 溫度適宜， 有利于花枝分化生長， 同化物供應(yīng)充分， 促使各種有效成分含有量積累較多。 在第1茬花采收后， 植物開始緩茬， 處于生理休眠期， 在6 至7 月溫度升高， 植株中各種營養(yǎng)供應(yīng)在植物縱向生長上， 不利于花枝的分化， 則第1 茬高于第2茬。 木犀草苷與花青素含有量測定結(jié)果顯示， 3 個品種金銀花葉片含有量均高于花， 與武雪芬等[18］報道金銀花總黃酮含有量葉＞花蕾相吻合。 在忍冬與“亞特青蕾” 金銀花綠原酸和木犀草苷含有量測定結(jié)果中， 莖枝高于葉片， 與前人研究結(jié)果相似， 由于莖枝與葉片采收時間處于全年生長后期，次生代謝物質(zhì)由葉片向莖枝運輸， 因此該部位中含有量高于葉片中。 在花青素含有量測定中， “亞特紅” 金銀花因其外觀呈紫紅色， 故遠高于另外2個品種。

5 結(jié)論

在3 個地上器官中， 葉片中木犀草苷與花青素積累量均高于花， 但綠原酸含有量較低， 因此可認(rèn)為葉片具有一定的藥用價值。 另外， 忍冬葉片有過冬不落的特點， 且不受物候期限制， 易獲得， 可大大降低成分提取來源成本。 “亞特紅” 金銀花屬良種， 耐旱、 抗病蟲害能力強， 常用于綠化、 觀賞。本實驗證實， 在綠原酸、 木犀草苷、 花青素含有量測定中， 西北地區(qū)種植的“亞特紅” 金銀花和忍冬達到《中國藥典》 要求， 其中前者有效成分含有量較高， 具有更大的藥用價值， 另外葉片也具有一定的再利用價值， 可為西北地區(qū)推廣種植良種金銀花提供參考依據(jù)， 并為擴大該品種資源， 改善西北生態(tài)環(huán)境作出貢獻。