朱詩(shī)竟， 李淞明， 詹常森

（上海和黃藥業(yè)有限公司， 上海中藥固體制劑創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心， 上海 201401）

麝香保心丸由人工麝香、 人參、 人工牛黃、 肉桂、 蘇合香、 蟾酥、 冰片7 味藥材組成， 是在蘇合香丸的基礎(chǔ)上研制而成， 功效芳香溫通、 益氣強(qiáng)心， 用于心肌缺血引起的心絞痛、 胸悶、 心肌梗塞， 對(duì)各類(lèi)型心絞痛均具有良好的治療效果[1］。方中肉桂性辛、 甘、 熱， 歸腎、 脾、 心、 肝經(jīng)， 具有補(bǔ)火助陽(yáng)、 散寒止痛、 溫通經(jīng)脈等作用， 主要含有揮發(fā)油、 二萜及其糖苷、 黃烷醇及其多聚體， 以及黃酮、 多酚等成分， 其中桂皮醛、 肉桂酸含有量測(cè)定的報(bào)道較多[2-7］， 2015 年版《中國(guó)藥典》[7］以前者為檢測(cè)指標(biāo)； 蟾酥味甘、 辛， 性溫， 有毒， 具有解毒、 消腫、 醒神、 開(kāi)竅、 強(qiáng)心、 止痛等作用，主要含有蟾蜍毒素、 蟾毒配基、 蟾毒色胺等成分[8-13］， 2015 年版《中國(guó)藥典》[14］以華蟾酥毒基、酯蟾毒配基為檢測(cè)指標(biāo)。

日蟾毒他靈、 蟾毒靈、 華蟾酥毒基、 肉桂酸為麝香保心丸入血成分； 蟾毒他靈、 酯蟾毒配基均為蟾酥活性成分群——蟾蜍甾二烯類(lèi)， 而且后者是藥典規(guī)定的蟾酥含有量測(cè)定指標(biāo)成分； 香豆素為肉桂中活性成分。 因此， 本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定麝香保心丸中間體中上述7 種成分的含有量， 以期為該制劑全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀， 配置四元梯度泵、 二極管陣列檢測(cè)器、 控溫柱溫箱、 自動(dòng)進(jìn)樣器、 ChemStation 工作站（美國(guó)Agilent 公司）； XS205DU 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； SB-5200DTD 超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 肉桂酸（批號(hào)110786-200503）、 蟾毒靈（批號(hào)111981-201503）、 華蟾酥毒基 （批號(hào)110803-201406）、酯蟾毒配基（ 批 號(hào) 110718-201108） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；日蟾毒他靈 （批號(hào)150809）、 蟾毒他靈 （批號(hào)150926） 對(duì)照品均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司； 香豆素（批號(hào)C4261-50G） 對(duì)照品購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海） 貿(mào)易有限公司。 麝香保心丸中間體（上海和黃藥業(yè)有限公司， 批號(hào)20160605、20160606、 20160609）。乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher公司）； 其他試劑均為分析純； 水為超純水（美國(guó)Millipore 超純水儀制備）。

2方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸， 梯度洗脫， 程序見(jiàn)表1； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量， 置于同一10 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度， 即得（日蟾毒他靈0.17 mg／mL、 香豆素0.081 1 mg／mL、 肉桂酸0.057 1 mg／mL、 蟾毒他靈0.365 5 mg／mL、 蟾毒靈0.351 5 mg／mL、 華蟾酥毒基0.441 5 mg／mL、酯蟾毒配基0.415 5 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取中間體適量， 研磨后精密稱(chēng)取2 g， 置于具塞三角燒瓶中， 加入20 mL 甲醇，密塞， 稱(chēng)定質(zhì)量， 超聲30 min， 放冷， 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜， 取續(xù)濾液， 即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方和制備工藝去掉肉桂、 蟾酥、 蘇合香， 將人工麝香、 人參提取物、人工牛黃、 冰片細(xì)粉混勻， 作為陰性樣品， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性考察與專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、 陰性樣品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖1。 由圖可知， 各成分色譜峰分離度均＞1.5， 陰性無(wú)干擾， 方法專(zhuān)屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見(jiàn)表2， 可知各成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得日蟾毒他靈、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他靈、 蟾毒靈、 華蟾酥毒基、 酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.12%、 0.17%、 0.24%、 0.21%、 0.19%、 0.18%、2.04%， 表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批中間體， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 于0、 2、 4、6、 8、 12 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得日蟾毒他靈、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他靈、 蟾毒靈、 華蟾酥毒基、 酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為2.68%、 0.57%、 2.35%、 0.76%、 0.76%、 0.80%、2.75%， 表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批中間體， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得日蟾毒他靈、香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他靈、 蟾毒靈、 華蟾酥毒基、 酯蟾毒配基含有量RSD 分別為1.35%、1.11%、 2.30%、 1.19%、 1.39%、 1.13%、 0.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，加到含有量已知的同一批中間體中， 平行6 份， 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算回收率。 結(jié)果， 日蟾毒他靈、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他靈、 蟾毒靈、 華蟾酥毒基、 酯蟾毒配基平均加樣回收率分別為98.73%（RSD=1.56%）、 99.16% （RSD=0.93%）、 98.24%（RSD=1.64%）、 102.49% （RSD=1.27%）、 100.05%（RSD=1.86%）、 100.64% （RSD=2.12%）、 100.26%（RSD=2.87%）。

2.4 樣品含有量測(cè)定 取3 批中間體， 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／g， n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑和提取方式， 綜合考慮試劑毒性、 提取效率、 色譜峰分離度及響應(yīng)值， 最終確定供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

3.2 陰性樣品制備方法選擇 7 種成分均為肉桂或蟾酥中所含， 同時(shí)蘇合香中含有桂皮醛， 并且易被氧化成肉桂酸， 故在陰性樣品中不含肉桂、 蟾酥、 蘇合香。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定麝香保心丸中間體中日蟾毒他靈、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他靈、 蟾毒靈、 華蟾酥毒基、 酯蟾毒配基的含有量， 該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確， 重復(fù)性好， 可為該制劑全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。