李 超， 田 剛， 吳 菲， 朱法根， 劉 雪， 石心紅， 封 亮，?， 賈曉斌

（1. 濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司， 江蘇 泰興 225400； 2. 中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 江蘇 南京 211198）

小兒豉翹清熱顆粒由淡豆豉、 連翹、 薄荷、 荊芥、 梔子 （炒）、 大黃、 青蒿、 赤芍、 檳榔、 厚樸、 黃芩、 半夏、 柴胡、 甘草14 味藥材組成， 具有疏風(fēng)解表、 清熱導(dǎo)滯的功效， 用于小兒風(fēng)熱感冒夾滯證[1-2］， 臨床上可治療小兒手足口病、 皰疹性咽炎、 急性扁桃體炎、 發(fā)熱、 急性上呼吸道感染[3-4］， 方中荊芥、 薄荷、 連翹、 柴胡是提取其揮發(fā)油后通過包合物加到產(chǎn)品中， 區(qū)別于其他8 味藥材。 目前， 關(guān)于小兒豉翹清熱顆粒中有效成分質(zhì)量控制的研究主要集中在HPLC／UPLC 法對(duì)1 種或多種成分含有量進(jìn)行測(cè)定， 尚無揮發(fā)性成分的報(bào)道[5-7］。 為了更好地控制小兒豉翹清熱顆粒質(zhì)量，保證該制劑療效穩(wěn)定， 本實(shí)驗(yàn)建立GC 法[8-9］同時(shí)測(cè)定其中9 種揮發(fā)性成分的含有量， 為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料

小兒豉翹清熱顆粒 （無糖）， 2 g／袋， 批號(hào)1801054， 購(gòu)于濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司。 Agilent 7890B 氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）， 配置FID 檢測(cè)器； XS205DU 電子分析天平（十萬分之一， 瑞士梅特勒-托利多公司）； DF-101T 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）。α-蒎烯（批號(hào)D8-11-4， 含有量98.8%）、 β-蒎烯（批號(hào)CCHM700571-1601， 含有量97.5%）、 月桂烯（批號(hào)D8-11-3， 含有量90.7%）、 薄荷酮（批號(hào)D6-11-3， 含 有 量 99.8%）、 檸 檬 醛 （批 號(hào)CCHM700474-1512， 含有量98.2%） 對(duì)照品均購(gòu)于美國(guó)Cato 公司； 檸檬烯（批號(hào)100470-201503，含有量96.0%）、 芳樟醇（批號(hào)1503-200001， 含有量100%）、 薄荷腦（批號(hào)110728-200508， 含有量100%）、 胡薄荷酮（批號(hào)111706-201606， 含有量99.8%） 對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。 乙酸乙酯為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 DB-1 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）， 程序升溫（起始溫度70 ℃， 2 ℃／min升至80 ℃， 維持15 min， 2 ℃／min 升至110 ℃，維持5 min， 60 ℃／min 升至290 ℃， 維持20 min）；進(jìn)樣口溫度230 ℃； 檢測(cè)器溫度280 ℃； 分流比30 ∶1； 柱體積流量0.5 mL／min； 進(jìn)樣量1 μL； 溶劑乙酸乙酯； 載氣氮?dú)狻?理論塔板數(shù)按檸檬烯峰計(jì)， 不低于4 000。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取顆粒約20 g， 置于500 mL 圓底燒瓶中， 加200 mL 水， 揮發(fā)油提取器部分加水至溢后， 加入1 mL 乙酸乙酯， 按照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部通則2204 甲法提取揮發(fā)油， 分取乙酸乙酯層， 定容至2 mL， 搖勻， 與乙酸乙酯按1 ∶1 比例稀釋， 即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品α-蒎烯10.37 mg、 β-蒎烯39.20 mg、 檸檬烯195.25 mg、芳 樟 醇10.49 mg、 薄 荷 酮15.55 mg、 薄 荷 腦66.94 mg、 胡薄荷酮11.26 mg， 置于2 mL 量瓶中； 精密稱取月桂烯10.41 mg， 置于5 mL 量瓶中； 精密稱取檸檬醛10.50 mg， 置于10 mL 量瓶中， 乙酸乙酯稀釋至刻度， 即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照工藝制備缺柴胡、連翹、 荊芥、 薄荷的陰性樣品， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、 供試品、 陰性樣品溶液各1 μL， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見圖1。 由圖可知， 供試品溶液中各成分色譜峰分離度理想， 陰性無干擾， 方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品α-蒎烯11.42 mg、 β-蒎烯40.58 mg、 芳樟醇10.75 mg、薄荷酮30.38 mg、 胡薄荷酮10.55 mg 于同一2 mL量瓶中， 乙酸乙酯稀釋至刻度， 作為溶液①； 精密吸取“2.3” 項(xiàng)下月桂烯、 檸檬烯、 薄荷腦、 檸檬醛對(duì)照品溶液及溶液①各1 mL， 置于同一5 mL 量瓶中， 乙酸乙酯定容， 精密吸取適量， 乙酸乙酯稀釋成系列質(zhì)量濃度， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見表1， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.125 mL 于5 mL 量瓶中， 乙酸乙酯稀釋至刻度， 吸取它和供試品溶液各1 μL， 于0、 4、 6、 8、10、 12、 18、 24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 檸檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷腦、 胡薄荷酮、 檸檬醛對(duì)照品溶液峰面積RSD 分別為1.1%、 1.3%、 1.1%、1.5%、 1.9%、 1.8%、 1.9%、 1.9%、 6.7%， 供 試品溶液分別為0.37%、 0.38%、 0.89%、 0.71%、1.6%、 1.3%、 1.2%、 1.6%、 2.9%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 每次1 μL， 測(cè)得α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 檸檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷腦、 胡薄荷酮、 檸檬醛峰面積RSD 分別為1.2%、 1.3%、 1.0%、 1.3%、 1.3%、 1.3%、1.4%、 1.1%、 7.9%， 表明儀器精密度良好。

圖1 各成分GC 色譜圖Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒， 按“2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 檸檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷腦、 胡薄荷酮、 檸檬醛含有量RSD 分別為2.6%、 2.7%、3.2%、 2.6%、 2.9%、 2.8%、 2.7%、 2.9%、5.3%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的顆粒6 份， 每份10 g， 置于500 mL 圓底燒瓶中， 精密加入適量對(duì)照品溶液， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。 結(jié)果， α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 檸檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷腦、 胡薄荷酮、 檸檬醛平均加樣回收率分別為101.2%、 101.5%、100.6%、 97.36%、 96.39%、 102.2%、 98.02%、99.95%、 98.32%， RSD 分 別 為 1.4%、 2.1%、2.8%、 2.6%、 1.3%、 1.7%、 2.8%、 2.4%、 2.6%。

2.11 樣品含有量測(cè)定 取9 批顆粒， 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)比較DB-1 （30 m×0.25 mm， 0.25 μm）、 CAM （30 m× 0.53 mm，1.0 μm）、 DB-5 ms （30 m×0.25 mm， 0.5 μm）、DB-WAX （30 m×0.25 mm， 0.25 μm） 毛細(xì)管色譜柱， 發(fā)現(xiàn)采用DB-1 色譜柱分析時(shí)各成分分離度理想。 通過程序升溫考察初始溫度、 柱體積流量、 升溫速率、 分流比對(duì)色譜峰分離度的影響， 最終確定初始溫度為70 ℃， 柱體積流量為0.5 mL／min， 分流比為30 ∶1。 采用2015 年版《中國(guó)藥典》 四部通則2204 甲法提取揮發(fā)油， 發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)提取有很大影響， 最終確定其為140 ℃。 研究石油醚、 乙酸乙酯對(duì)色譜峰的影響， 最終確定后者作為提取溶劑。 考察恒溫、 程序升溫對(duì)各成分分離度的影響，發(fā)現(xiàn)恒溫時(shí)分離度不理想， 最終確定在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)行程序升溫。

3.2 含有量分析 表3 顯示， 9 批小兒豉翹清熱顆粒中各成分含有量有明顯差異， 以檸檬醛、 檸檬烯更顯著， 可能是由于不同批次樣品所用藥材中揮發(fā)油差異較大所致[10-11］。 因此， 有必要建立該成分含有量標(biāo)準(zhǔn)， 控制成品質(zhì)量穩(wěn)定均一， 從而確保療效。