張 彬 張 瑜

四川省成都市第五人民醫(yī)院肝膽外科 611130

肝細(xì)胞癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，術(shù)后伴有不良反應(yīng)的患者5年生存率只有5%左右[1]。主要原因是晚期肝細(xì)胞癌的手術(shù)機(jī)會(huì)小，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致肝細(xì)胞癌患者的治療現(xiàn)狀改善不明顯[2-3]。探討研究肝細(xì)胞癌的分子發(fā)病機(jī)制是研究臨床治療的熱點(diǎn)方向。miRNA是由20～22個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，通過(guò)特異性結(jié)合和切割信使RNAs(mRNAs)，抑制mRNA翻譯和脫氨基化來(lái)抑制其同源靶基因的表達(dá)[4]。miRNA已被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)因子。miRNA表達(dá)的異常調(diào)節(jié)在惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中經(jīng)常存在明顯的表達(dá)差異[5]。另一方面，miRNA的異常表達(dá)與肝癌的發(fā)展相關(guān)[6]。例如，miR-122、mi-26a及miR-195已經(jīng)被鑒定為肝臟中的腫瘤抑制劑，而miR-21和miR-221可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌變[7]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化行為的特征是細(xì)胞黏附性的喪失，上皮細(xì)胞黏附蛋白E-鈣粘著蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的下調(diào)，可以直接干擾影響[8]。據(jù)相關(guān)研究證實(shí)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化行為可直接促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤抗藥性的產(chǎn)生[9]。然而，miR-194在肝細(xì)胞的進(jìn)展和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用一直沒(méi)有得到很好的驗(yàn)證。

miR-194在肝臟中的表達(dá)差異被發(fā)現(xiàn)很久，但其具體功能機(jī)制尚未明確。有研究表明miR-194在腸上皮細(xì)分化過(guò)程中可以誘導(dǎo)其進(jìn)展[10]。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳暗难芯恐校紫仍诟伟┙M織和肝癌細(xì)胞中分析miR-194的表達(dá)差異，然后通過(guò)調(diào)控鈣粘連蛋白的表達(dá)干擾其生物學(xué)行為進(jìn)程，直接影響肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移行為。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng) 在本地醫(yī)院獲得肺癌患者書(shū)面知情同意后，采集肝癌組織樣本和癌旁正常組織樣本，本研究獲得醫(yī)學(xué)院審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。蠟塊包埋的腫瘤樣品用于免疫組織化學(xué)研究。HepG2、Hep3B、SNU398和SNU475肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件：10%胎牛血清補(bǔ)充的改良Eagle培養(yǎng)基，37℃，5%CO2恒溫孵箱中培育。

1.2 PCR實(shí)驗(yàn) 使用mirVana miRNA分離試劑盒從肝癌組織和對(duì)照癌旁正常組織中分離總RNA。使用Nano-2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min、95℃變性15s、60℃退火32s，循環(huán)50次后檢測(cè)其溶解曲線，檢測(cè)完成后，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miR-194引物序列：5’-GTAGCGGTAGCGGATGCGGAGC-3’(正向)和5’-GGATCTATCCCCTAGCGAGTAGGGC-3’(反向)。

1.3 蛋白質(zhì)印跡測(cè)定 使用RIPA緩沖液提取總細(xì)胞裂解物，通過(guò)配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與一抗(濃度1∶1 000)一起孵育過(guò)夜。 隨后，將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)通過(guò)將肝癌細(xì)胞接種到六孔板上進(jìn)行測(cè)定。在肝癌細(xì)胞附著于平板并達(dá)到100%匯合后，使用無(wú)菌吸頭通過(guò)匯合單層進(jìn)行刮擦。觀察細(xì)胞遷移到劃痕區(qū)域的細(xì)胞距離，并拍攝照片，并且對(duì)5個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。在含有0.1%牛血清白蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基中將肝癌細(xì)胞加入到上室中，通過(guò)基質(zhì)膠侵入下室的細(xì)胞數(shù)量用結(jié)晶紫染色劑染色，并在37℃，5%CO2下孵育24～36h后計(jì)數(shù)。觀察細(xì)胞侵襲到下層小室區(qū)域的細(xì)胞數(shù)目，并拍攝照片，并且對(duì)5個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：將不同組的2×107的肝癌細(xì)胞分別離心，用50μl PBS稀釋重懸待用。10只4周左右的裸鼠，分為miR-194-inhibitor組和NC組，每組5只，將兩組肝癌細(xì)胞分別注射入左側(cè)腋下，2周觀察腫瘤形成情況。6周后將腫瘤剝除，將腫瘤組織包埋切片進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS17.0(SPSS，Chicago，USA)進(jìn)行。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Student’st檢驗(yàn)。 使用Pearson相關(guān)分析來(lái)估計(jì)CCAT1和miR-410的表達(dá)水平之間的關(guān)系。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-194在不同肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-194在肝癌組織中的表達(dá)情況。qPCR結(jié)果顯示：miR-194在肝癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(1.28±0.16 VS 0.37±0.03)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞株中結(jié)果顯示：miR-194在HepG2肝癌細(xì)胞中的表達(dá)最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取HepG2肝癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-194在肝癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況

2.2 miR-194調(diào)控鈣粘蛋白的表達(dá)水平 通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-194對(duì)肝癌細(xì)胞中鈣粘蛋白的表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)：轉(zhuǎn)染了miR-194-inhibitor后，E-Cadherin，N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平相比NC組均明顯降低(1.81±0.22 VS 0.52±0.08，2.96±0.39 VS 0.51±0.09，2.06±0.24 VS 1.62±0.22)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明抑制miR-194后可以調(diào)控相關(guān)鈣粘蛋白的表達(dá)，從而干擾肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。

圖2 miR-194對(duì)鈣粘蛋白表達(dá)水平的影響情況

2.3 miR-194對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，與NC對(duì)照組相比，抑制miR-194后72h肝癌細(xì)胞的遷移能力得到一定程度的減弱[(82.6±15.3)%VS(29.1±8.2)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC對(duì)照組相比，抑制miR-194后肝癌細(xì)胞的侵襲能力得到一定程度的減弱[(332.6±29.4)%VS(136.8±16.4)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明抑制miR-194的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲運(yùn)動(dòng)能力有一定的抑制作用。

2.4 miR-194對(duì)肝癌細(xì)胞體外成瘤能力的影響 兩組小鼠在肝中的轉(zhuǎn)移灶不明顯，對(duì)轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織進(jìn)行蘇木精—伊紅染色的組織切片。結(jié)果如圖4所示，抑制miR-194的表達(dá)后可以在一定程度上降低裸鼠體內(nèi)中腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。表明抑制miR-194的表達(dá)可以干擾肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)展進(jìn)程。

圖3 miR-194對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

圖4 蘇木精—伊紅染色裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移灶的情況

3 討論

雖然miR-194在肝臟中的高表達(dá)情況早已證明，但其相關(guān)功能機(jī)制了解不甚清楚。兩項(xiàng)關(guān)于人上皮細(xì)胞分化和肝纖維化的研究揭示了miR-194的可能功能行為。因?yàn)檫@兩個(gè)過(guò)程涉及上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用或轉(zhuǎn)換，筆者推測(cè)miR-194可能在肝上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)并在模仿EMT的分化過(guò)程中的調(diào)控作用。進(jìn)一步確定miR-194在上皮細(xì)胞中的一個(gè)潛在作用是調(diào)控E-Cadherin和N-cadherin的表達(dá)并阻礙EMT期間的鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換。從而使肝癌細(xì)胞系中miR-194的表達(dá)降低下調(diào)N-cadherin的表達(dá)并抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程[11]。另外有相關(guān)研究表明miR-194的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)逆轉(zhuǎn)某些細(xì)胞情況下的細(xì)胞分化狀態(tài)，可能是通過(guò)釋放間充質(zhì)細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制[12]。盡管這些結(jié)果并不能在完全意義上證實(shí)過(guò)程，但是揭示了miR-194在維持腫瘤細(xì)胞上皮表型和預(yù)防EMT過(guò)程中潛在的作用[13-14]。

筆者的研究結(jié)果表明，miR-194可能特異性地抑制E-鈣粘蛋白表達(dá)和N-鈣粘蛋白表達(dá)，但對(duì)Vimentin蛋白沒(méi)有直接的影響作用。在臨床情況下，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞并不總是需要完整的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)揮作用，因?yàn)閂imentin在許多轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)差異不明顯。此外，雖然Vimentin蛋白的喪失被認(rèn)為是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一，但E-鈣粘蛋白表達(dá)和N-鈣粘蛋白可能是通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移的必需因子[15]。所以如果E-鈣粘蛋白表達(dá)和N-鈣粘蛋白的外源表達(dá)有明顯差異，無(wú)論Vimentin的表達(dá)如何，肝癌細(xì)胞都能促進(jìn)遷移和侵襲[16]。此外，有報(bào)道認(rèn)為N-鈣粘蛋白可以促進(jìn)原發(fā)性肝癌的生長(zhǎng)，并對(duì)肝癌細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用[17]。因此，miR-194調(diào)控E-cadherin和N-cadherin可能在腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要和多方面的作用

綜上所述，miR-194可能通過(guò)調(diào)控鈣粘蛋白的相關(guān)表達(dá)直接影響肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而直接干擾肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為，本研究結(jié)果表明，miR-194是一種潛在的肝癌上皮細(xì)胞的miRNA標(biāo)記，并且在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中起著抗轉(zhuǎn)移的作用。 因此，miR-194可能是肝癌的預(yù)后和治療的潛在靶標(biāo)。