李佳雨,林家怡,裴晨羽,黃 林,黃銳洲,唐光大

華南農業(yè)大學林學與風景園林學院/中國南方石灰?guī)r植物研究中心, 廣州 510640

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬植物的總稱。由于其環(huán)境適應能力強、生長迅速、輪伐期短、產量高,具有較高的經濟價值,已被廣泛引種栽培[1- 2]。目前,全世界約5000萬hm2的熱帶人工林中,桉樹的種植面積占了40%[3- 4]。中國是世界上第二大桉樹生產國,截至2016年,種植面積已經達到368萬hm2,預計仍將以每年20萬hm2的速度增長[5]。在產生巨大經濟效益的同時,桉樹種植帶來的林下生物多樣性降低、生物棲息地減少等生態(tài)問題也不容忽視[6- 8]：一方面,桉樹根系和凋落物產生的化感物質直接或間接影響了土著植物的生長及光合作用等[9- 13]；另一方面,桉樹耗水耗肥量大,而大量的人工施肥改變了原生土壤的養(yǎng)分循環(huán)節(jié)奏,長期種植可能引起土壤質量變化。而在土壤質量變化過程中,理化特征和生物學性質等均會產生敏感響應。已有的研究結果顯示,桉樹的連續(xù)種植會導致土壤有機碳和全氮含量降低,同時降低土壤微生物的生物量碳和氮含量[14- 15]；而隨著種植年份的增加,土壤細菌群落結構會發(fā)生顯著變化[16- 18]。

AM真菌隸屬于球囊菌門,普遍存在于土壤環(huán)境中,能夠與80%以上的陸生植物形成共生體系[19],在利用植物提供的有機養(yǎng)分的同時,促進宿主植物對氮、磷等營養(yǎng)物質的吸收,提高植物抗逆抗病能力[20- 21],承擔著養(yǎng)分運輸、能量流動和信息傳遞等生態(tài)功能,對生物多樣性的維持和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用。同時,AM真菌可以減輕入侵植物對本土植物的消極影響,抑制入侵植物的化感作用,以維持入侵地的生態(tài)平衡[22- 23]。AM真菌群落結構也會受土壤類型、海拔高度、坡向、水分狀況和肥力等的影響[24- 25],植被類型和土壤理化性質的改變會造成AM真菌群落發(fā)生變化。例如,長期種植毛竹(Phyllostachysedulis(Car.) J. Houz.)會使 AM真菌生物量顯著降低,群落結構明顯改變,不利于土壤碳固存和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[26]；在人工種植柚木(TectonagrandisLinn.)的林地土壤中,也發(fā)現(xiàn)真菌孢子密度發(fā)生了顯著變化[27]。而對于桉樹人工林中AM真菌群落的變化特征,尚缺乏足夠的了解。

開展桉樹種植對林地土壤AM真菌影響的相關研究,探討大面積人工純林種植對土壤微生物環(huán)境的長期影響,對森林經營和植被恢復等具有較強的指導意義。本研究比較了次生林改種桉樹后,不同種植年份的桉樹林中土壤AM真菌種類、群落組成及多樣性的變化,試圖厘清桉樹林土壤中AM真菌群落隨種植年限的變化趨勢,以期為桉樹林的栽培管理和環(huán)境修復等提供理論依據(jù)。

1 研究樣地概況

研究樣地位于廣東省惠州市惠陽區(qū)鎮(zhèn)隆鎮(zhèn)(22°57′N,114°21′E),屬于亞熱帶季風性氣候,年平均降雨量約2000 mm,集中在4月至9月,年平均溫度為22℃,降雨量充足,光照豐富。試驗地選取皆伐種植的桉樹林,并以鄰近的次生林作為對照。桉樹林下最常見的植物有鹽膚木(RhuschinensisMill.),光葉山黃麻(TremacannabinaLour.),山麻桿(Alchorneatrewioides(Benth.) Muell. Arg.),春花(Rhaphiolepisindica(L.) Lindl. ex Ker),展毛野牡丹(MelastomanormaleD. Don),芒草(MiscanthussinensisAnderss.),山菅蘭(Dianellaensifolia(L.) DC.),異葉鱗始蕨(LindsaeaheterophyllaDry.)等；次生林中常見植物有馬尾松(PinusmassonianaLamb.),鼠刺(IteachinensisHook. et Arn.),鴨腳木(Scheffleraheptaphylla(Linn.) Frod.),山烏桕(Sapiumdiscolor(Champ. ex Benth.)Muell.-Arg.),黑面神(Breyniafruticosa(Linn.) Müll. Arg.),桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hass.),梅葉冬青(Ilexasprella(Hook. et Arn.) Champ. ex Benth),春花,芒草,異葉鱗始蕨,芒萁(Dicranopterispedata(Hout.) Nakai.),鬼燈籠(ClerodendrumfortunatumLinn.),烏毛蕨(BlechnumorientaleLinn.)等。

2 試驗方法和材料

樣本采集于2017年3月,在3個相鄰但種植年份不同的桉樹林(2年生、5年生和10年生)中進行,同時在鄰近的次生林樣地采集對照樣本。按照“S”型曲線在坡向相同、海拔相近(110—120 m)處設置10 m×10 m樣方,每個樣地設3個樣方,參照Qin等和Carrillo-Saucedo等的方法[28-29],樣方內以“5點取樣法”采集表層土壤(0—15 cm)共計1 kg左右；同時在不傷及植物根系結構的前提下,在樣方內采集桉樹根樣,放入FAA(Formalin-acetic acid-alcohol)固定液中。將同一樣方內的土壤樣品混合均勻,并剔除植物殘體及石礫,放入無菌封口袋,置于冰盒中迅速帶回實驗室。土壤樣品過4 mm篩后分成2份,保存于4℃冰箱：1份用于土壤理化性質的測定,另1份用于土壤AM真菌孢子的分離和鑒定。

2.1 土壤理化性質分析

2.2 AM真菌孢子鑒定與侵染率測定

采用濕篩傾析-蔗糖離心法[31]分離土壤AM真菌孢子,壓片,根據(jù)其形態(tài)特征,參考國際VA菌根網(wǎng)站(https://invam.wvu.edu/home)的鑒定圖片,形態(tài)描述及最新分類標準進行種屬的檢索和鑒定。

菌根侵染率測定步驟如下：將采集的根樣從FAA固定液中取出,剪成約1 cm長的根段,置于裝有10% KOH溶液的玻璃瓶中,放在90℃水浴鍋中消解至透明(根系產生明顯氣泡)；取出根樣,放入錐蟲藍乳酸甘油溶液(錐蟲藍0.24 g；乳酸10 mL；甘油160 mL；蒸餾水160 mL)中,染色15—60 min,將根段整齊擺放在載玻片上,蓋片后鏡檢。菌根侵染率的計算采用根段頻率常規(guī)法[32],在Leica光學顯微鏡下觀察每條根段的侵染情況,根據(jù)侵染點、菌絲、叢枝和泡囊等菌根結構所占比例,分為0—5共6個等級,然后根據(jù)叢枝和泡囊在菌根結構中的有無及豐富度,將1—5級劃分為A0,A1,A2,A3共4個級別。統(tǒng)計不同桉樹種植年份中AM真菌菌根侵染情況,每個年份隨機選取30條根段進行鏡檢計數(shù),最后將數(shù)據(jù)輸入MYCOCALC軟件計算菌根侵染率。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1AM真菌群落結構特征指標：

(1)AM真菌孢子密度和種豐度

孢子密度：指每100 g干土中孢子或孢子果的數(shù)量,其中1個孢子果按照1個孢子計數(shù)。

種豐度[33]：物種豐富度,以每個土壤樣本中AM真菌的物種數(shù)目表征。

(2)物種多樣性指數(shù)和均勻度

本文采用香農指數(shù)、辛普森指數(shù)和均勻度表示物種多樣性及分布情況。

香農指數(shù)(H)=-∑(PilnPi)

辛普森指數(shù)(D)=1-∑(Pi)2

均勻度指數(shù)(J)=H/lnS

式中,Pi表示土樣中種i的AM真菌孢子數(shù)ni與孢子總數(shù)N的比值；S為土樣中AM真菌種的數(shù)目。

2.3.2統(tǒng)計分析

采用“Microsoft Excel 2017”軟件對土壤理化性質、孢子密度、種豐度、物種相對豐度和多樣性指數(shù)等數(shù)據(jù)進行錄入及初步分析；采用SPSS 19.0進行單因素方差分析(不同組間土壤性質和AM真菌豐度差異等)；采用非度量多維尺度法(Nonmetric Multi-Dimensional Scaling,NMDS)對Bray-Curtis距離進行降維分析以解析群落結構；進一步通過冗余分析(Redundancy Analysis, RDA)解析不同環(huán)境因子對于AM真菌群落結構的影響,并通過999次蒙特卡洛置換來檢驗因子的顯著性。Bray-Curtis距離計算、矩陣降維及RDA均在R 3.3.3中使用 “vegan”包計算[34]。

3 結果與分析

3.1 桉樹種植對土壤理化性質的影響

表1 不同桉樹種植年份土壤理化性質

同一列不同字母代表組間差異顯著(P<0.05)

3.2 桉樹種植對土壤AM真菌群落的影響

3.2.1AM真菌種類變化

從所有的檢測樣本中鑒定出AM真菌共9屬18種,其中無梗囊霉屬Acaulospora6種,斗管囊霉屬Funneliforms4種,球囊霉屬Glomus1種,原囊霉屬Archaeospora1種,和平囊霉屬Pacispora1種,近明球囊霉屬Claroideoglomus1種,盾巨孢囊霉屬Scutellospora1種,根孢囊霉屬Rhizophagus2種,隔球囊霉屬Septoglomus1種(表2)。次生林土壤中的AM真菌種類最多(15種),2年生、5年生和10年生桉樹林土壤中分別分離出11種、9種和13種AM真菌,均少于次生林真菌種類。其中,A.bireticulata、Acaulosporasp1、F.mosseae、F.geosporus、F.verruculosus、Funneliformssp1和Glomussp1在次生林和所有桉樹林土壤中均有發(fā)現(xiàn),Pacisporasp1和Scutellosporasp1只在次生林中存在。另外,A.spinosa、Archaeosporasp1、Claroideoglomussp1和Rhizophagussp2在5年生桉樹林中未發(fā)現(xiàn),卻在2年生、10年生桉樹林和次生林中存在。A.capsicula和S.deserticola只在桉樹林中存在,在次生林中未發(fā)現(xiàn)。

3.2.2AM真菌孢子密度和種豐度變化

在2年生、5年生、10年生桉樹林及次生林土壤中,每100 g干土中孢子個數(shù)分別為2520個、1553個、2953個和6233個。整體而言,桉樹林土壤中的真菌孢子密度顯著低于次生林,在2年生桉樹林土壤中明顯下降,5年生土壤中降到最低,但在10年生桉樹林土壤中得到一定程度恢復(圖1)。AM真菌種豐度變化與之類似,桉樹林的土壤AM真菌種豐度明顯低于次生林(11.33),隨種植年份的增加逐漸下降,在10年生桉樹林土壤中亦有所恢復(圖2)。

表2 不同桉樹種植年份土壤AM真菌群落組成變化

“+”表示有,“-”表示無

圖1 不同桉樹種植年份土壤AM真菌孢子密度 Fig.1 Spore density of soil AM fungi in differentEucalyptusplanting years

圖2 不同桉樹種植年份土壤AM真菌種豐度 Fig.2 Species richness of soil AM fungi in differentEucalyptusplanting years

3.2.3不同種植年限的桉樹林土壤中AM真菌菌根侵染變化

5年生桉樹根系的AM菌根侵染率最高,其次是2年生,而10年生的根系菌根侵染率最低；叢枝豐富度方面,5年生桉樹根系的豐富度最高,其次是10年生、2年生(表3)。

3.2.4AM真菌孢子多樣性和均勻度

土壤中AM真菌在桉樹種植2年時香農指數(shù)和辛普森指數(shù)分別最高,而種植5年時均為最低,但單因素方差分析比較結果顯示：組間多樣性指數(shù)差異不顯著(P<0.05)。桉樹種植2年的土壤中AM真菌均勻度最高,顯著高于5年生及次生林土壤,但與10年生的土壤相比差異不顯著(表4)。

表3 不同桉樹種植年份根系侵染率(%)

表4 不同桉樹種植年份土壤AM真菌孢子多樣性和均勻度

3.2.5AM真菌群落結構

圖3 不同桉樹種植年份土壤AM真菌非度量多維尺度分析 Fig.3 Nonmetric Multi-Dimensional Scaling (NMDS) of AM fungi in differentEucalyptusplanting years

非度量多維尺度分析(NMDS)結果顯示,桉樹林與次生林的AM真菌群落組成存在明顯差異,相互距離較遠,尤其是2年生和5年生桉樹林的樣本,差異最大；在不同種植年份中,AM真菌群落組成不同,在圖中分布在不同的位置(圖3)。

根據(jù)不同組間孢子相對豐度的計算和單因素方差分析,次生林、5年生和10年生桉樹林土壤中優(yōu)勢種為Funneliformsgeosporus,但在2年生土壤中顯著降低；而2年生的優(yōu)勢種為Septoglomusdeserticola,平均相對豐度為36.28%,顯著高于5年生和次生林；Archaeosporasp1在次生林土壤中占比相對較高,為8.65%,顯著高于其他桉樹林土壤；Funneliformsmosseae在2年生桉樹林土壤中占比相對較高,為10.64%,顯著高于其他年份的桉樹林和次生林土壤；F.verruculosus在2年生和10年生土壤中顯著高于次生林；Acaulosporabireticulata的相對豐度在10年生土壤中有顯著增長,達到4.7%；Acaulosporasp2在桉樹種植2年生土壤中未發(fā)現(xiàn),但在5年生和10年生土壤中有所恢復,且與次生林接近(圖4)。另外,Pacisporasp1和Scutellosporasp1僅在次生林土壤樣本中出現(xiàn),且豐度較低,在不同年份之間無明顯組間差異。

圖4 不同桉樹種植年份土壤AM真菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of soil AM fungi in differentEucalyptusplanting years

圖5 不同桉樹種植年份土壤AM真菌與土壤理化因子冗余分析Fig.5 Redundancy Analysis (RDA) between AM fungi community and soil properties in differentEucalyptusplanting years

3.3 環(huán)境因子對桉樹林土壤中AM真菌群落的影響

土壤AM真菌群落與土壤環(huán)境因子的冗余分析(RDA)結果顯示(圖5),土壤pH、SOC、TN、TK是影響土壤AM真菌群落的主要因子,RDA1解釋率為82.3%,表明土壤理化性質是影響土壤中AM真菌群落結構的主要因素,在次生林中與pH、SOC、TN、TK呈正相關關系；RDA2的解釋率僅為4.36%,主要影響因子為TK。根據(jù)蒙特卡洛置換試驗結果,pH、TN、SOC和TK作為具有顯著影響的環(huán)境因子,在第一軸上的解釋率分別為89.88%,57.72%,34.69%和33.2%,表明pH值是土壤中AM真菌群落的主要影響因子。

4 討論

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中,土壤微生物能夠影響植被生長、群落組成和多樣性,同時陸地植被的改變也會影響土壤中微生物生態(tài)系統(tǒng),兩者形成動態(tài)相互作用的關系。植物通過根系分泌物、凋落物的淋溶、分解、釋放化合物質等,直接或間接改變土壤微生物的組成和結構[35]。桉樹作為外來樹種被廣泛引種種植,將物種多樣性較高的原生植被替代為桉樹純林,其自身生理代謝和人為管理措施(施肥、灌溉等)都可能使土壤理化性質發(fā)生改變,如SOC降低[14,36-37]。本研究結果顯示,2年生和10年生桉樹林中,土壤SOC顯著降低,可能是因為桉樹種植對土壤團聚體產生了影響,從而引起土壤中SOC的降低[38]；5年生桉樹林土壤SOC顯著高于2年和10年桉樹林,這可能是第5年桉樹凋落物積累較多,而土壤微生物分解率低所造成的結果[39],而凋落物淋溶產生的化感物質形成了不利于AM真菌孢子生長和繁殖的環(huán)境,導致孢子密度和種豐度顯著降低；有研究表明土壤SOC與AM真菌侵染狀況呈顯著正相關[40],這可能是5年生土壤中AM真菌侵染率較高的原因之一。其他土壤營養(yǎng)元素,如TP、AP等在桉樹林中的增加和降低也可能與凋落物的分解、淋溶、礦化等有關[41-42]。

當宿主植被群落發(fā)生改變時,土壤中AM真菌的種類和結構可能會隨之改變；而當土壤中AM真菌群落改變后,地表植物的種類和數(shù)量可能也會改變,植物群落結構和多樣性也隨之改變[43]。本研究結果證實了桉樹種植使土壤中的AM真菌孢子密度和種豐度顯著降低,真菌群落發(fā)生了顯著改變。然而,AM真菌種類和群落改變后,是否引起桉樹林下植被和多樣性發(fā)生改變,尚需進一步開展相關研究。林地土壤中,P含量是影響AM真菌孢子密度的因素之一,與孢子密度呈負相關[44],本研究發(fā)現(xiàn)TP和AP含量高的桉樹林土壤中,孢子密度相對較低,故土壤營養(yǎng)元素的變化,也會影響AM真菌的種類和多樣性。

從AM真菌屬種水平分析結果來看,Acaulospora屬和Funneliforms屬在種植前后均為土壤中AM真菌的優(yōu)勢屬,這與其他陸地生態(tài)系統(tǒng)中土壤優(yōu)勢屬相吻合[45-47],說明桉樹的種植對土壤中AM真菌優(yōu)勢屬的影響較小。然而,F.geosporus作為次生林中的優(yōu)勢種,在種植桉樹后相對豐度顯著降低,冗余分析結果顯示pH值對土壤AM真菌群落影響較大,可能桉樹種植后,土壤酸化對F.geosporus繁殖和生長產生了抑制。Pacisporasp1和Scutellosporasp1在次生林中存在,而在桉樹種植后消失,可能與土壤理化因子的變化有關。A.capsicula和S.deserticola是桉樹林土壤中分離到,但未在次生林中發(fā)現(xiàn)的種類,可能這兩種AM真菌對桉樹林土壤環(huán)境有較強的適應能力。桉樹的種植對AM真菌多樣性指標影響較小,可能是土壤中AM真菌物種的增加或減少在植被改變后得到了及時補償,有些真菌減少或消失,但有些真菌又新增。

土壤pH作為衡量土壤狀況的一個重要指標受地面植被類型影響較大,桉樹的種植容易導致土壤pH值降低[48-49]。本研究結果表明,2年生和10年桉樹林土壤pH值顯著降低,可能桉樹種植加快了土壤中酸性離子的積累[50]。AM真菌孢子密度與土壤pH值呈負相關[51],因此5年生桉樹林土壤AM真菌孢子密度和種豐度較低可能與土壤pH升高有關。另外,酸性的土壤環(huán)境更適應AM真菌中Acaulospora屬的生長[52],這可能是桉樹林在2年生和10年生時Acaulospora屬孢子的相對豐度均高于次生林和5年生的原因之一。

本研究采用濕篩傾析法分離土壤AM真菌孢子,土壤清洗過程中部分孢子可能會丟失,結果有一定的誤差,但鑒定依據(jù)較為充分,調查結果可反映AM真菌群落狀況,與高通量測序法相比,鑒定更加準確,并能獲得孢子密度等統(tǒng)計數(shù)據(jù)。后期研究中,建議濕篩傾析法與高通量測序方法相結合,充分探討森林植被改變后土壤真菌群落和多樣性的相關變化。森林土壤生態(tài)系統(tǒng)中,AM真菌與植物根系形成非常復雜的地下生態(tài)網(wǎng)絡,森林植被的改變,土壤真菌系統(tǒng)也可能發(fā)生變化,相關機制有待深入研究。