伊莉，趙處敏，馮翠萍，王曉聞，吳鎖柱，延莎

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

獼猴桃是我國(guó)種植量非常大的一種水果，大多數(shù)的省份都有種植。獼猴桃廣受喜愛(ài)，很重要的一個(gè)原因就是其果實(shí)中含有大量的抗衰老物質(zhì)，可以有效的清除人體內(nèi)的自由基[1-3]。除此之外，獼猴桃皮中也含有黃酮等功能活性物質(zhì)，可以加以利用。但大多數(shù)企業(yè)為了追求效益，也限制于生產(chǎn)加工工藝和技術(shù)的落后，大多將獼猴桃皮丟棄，或加工成動(dòng)物飼料，造成了極大的浪費(fèi)。

黃酮類物質(zhì)為存在于自然界中對(duì)人體有諸多益處的一類植物源化合物，多見(jiàn)于果蔬、茶、葡萄酒等食品中，黃酮類化合物越來(lái)越成為了藥理學(xué)和營(yíng)養(yǎng)保健食品學(xué)的研究重點(diǎn)，它所具有的抗癌，抗氧化等作用已經(jīng)在科學(xué)研究中發(fā)揮出巨大的作用，特別是在心腦血管方面，增加類黃酮攝入，可以降低患冠狀動(dòng)脈心臟病的危險(xiǎn)[4-7]。對(duì)于植物資源中黃酮類物質(zhì)的提取，常用的有熱水提取法和醇提法，熱水浸提法雖然成本低，但是用時(shí)較長(zhǎng)；醇提法是分離黃酮類物質(zhì)最常用的方法，提取效率高，操作簡(jiǎn)便[8-12]。獼猴桃皮中含有大量的鈣、鐵等微量元素，這些礦物質(zhì)元素易與有機(jī)大分子物質(zhì)螯合降低提取率。在提取同時(shí)加入螯合劑，可以與金屬離子絡(luò)合為金屬絡(luò)合物，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)金屬離子游離出有機(jī)大分子[13-15]。本試驗(yàn)采用螯合劑六偏磷酸鈉輔助乙醇溶劑浸提獼猴桃皮中的黃酮類物質(zhì)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定提取獼猴桃皮中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件，為提升獼猴桃皮的附加值提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

獼猴桃：市售；無(wú)水乙醇，硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、六偏磷酸鈉等均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%）：上海圻明生物科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

101-2 型電熱恒溫鼓風(fēng)干制箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1200 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；JY-15A 型多功能粉碎機(jī)：江業(yè)制造有限公司；HH4 型恒溫水浴鍋：常州澳華試驗(yàn)設(shè)備公司；TD5G 臺(tái)式低速離心機(jī)：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

精選七到八分熟的新鮮獼猴桃，洗凈，取果皮切成1 cm×1 cm 的小塊，放入60℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，待干燥后進(jìn)行粉碎，過(guò)60 目篩，得到獼猴桃皮粉末備用。

1.3.2 黃酮得率的計(jì)算

采用 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 光度法檢測(cè)黃酮含量，用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品參考文獻(xiàn)[3]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。獼猴桃皮黃酮的得率按式（1）計(jì)算。

式中：X 為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的黃酮含量，mg/g；N 為獼猴桃皮粉原液稀釋倍數(shù)，V 為原液體積，mL；M 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

精確稱取獼猴桃皮粉5 g，按照不同的料液比加入一定濃度的乙醇溶劑，同時(shí)按照不同比例加入螯合劑六偏磷酸鈉，置于不同溫度的恒溫水浴中提取一定時(shí)間，3 600 r/min 條件下離心10 min，取上清液。重復(fù)提取2 次，合并上清液。在波長(zhǎng)505 nm 處比色，根據(jù)1.3.2 的方法計(jì)算黃酮得率。各水平的選擇詳見(jiàn)表1。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)對(duì)結(jié)果的分析，從5個(gè)因素中選擇4個(gè)對(duì)獼猴桃皮黃酮得率影響較大的因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)工藝。

表1 單因素試驗(yàn)水平選擇Table 1 Factors and levels used in single-factor tests

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試驗(yàn)得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=12.228x+0.004 8，R2=0.999 7，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比的單因素試驗(yàn)結(jié)果

料液比的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.2 The effect of liquid-solid ratio on flavonoids extraction ratio

從圖2中可觀察到，當(dāng)料液比為 1∶20（g/mL）時(shí)，黃酮得率最高，達(dá)到1.032%。料液比在1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）范圍內(nèi)時(shí)，獼猴桃皮黃酮的得率并沒(méi)有隨之增大。綜合考慮成本因素，選取1∶20（g/mL）為最適合的料液比。

2.2.2 提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.3 The effect of time on flavonoids extraction ratio

從圖3中可觀察到，提取時(shí)間越長(zhǎng)，黃酮得率也在逐漸升高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到70 min 時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)黃酮得率為1.161%。隨著提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，獼猴桃皮黃酮的得率基本保持不變。因此，選取最適合的提取時(shí)間為70 min。

2.2.3 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

提取溫度對(duì)獼猴桃皮黃酮得率的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.4 The effect of temperature on flavonoids extraction ratio

由圖可知，在50℃～80℃范圍內(nèi)，提高提取溫度，黃酮得率逐漸提高。當(dāng)達(dá)到80℃時(shí)，得率達(dá)到最高，為1.341%。當(dāng)溫度高于80℃以上繼續(xù)升高時(shí)，黃酮得率不但沒(méi)有升高，反而有所下降?？赡艿脑蚴歉邷貙?dǎo)致黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞而影響了提取效果，因此選取最合適的溫度為80℃。

2.2.4 乙醇濃度的單因素試驗(yàn)結(jié)果

乙醇濃度的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

由圖5 分析可得，乙醇濃度越高，得率逐漸提高。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，得率達(dá)到最高，為1.356%。在高于70%時(shí)，提高乙醇濃度，獼猴桃皮黃酮的得率并沒(méi)有繼續(xù)升高，反而略有下降?？赡艿脑?yàn)橛捎谔崛∫褐谐S酮外的其他物質(zhì)隨著乙醇濃度的升高，溶解度升高，提取量也隨之加大，阻礙了黃酮的提取。因此選取最合適的乙醇濃度為70%。

圖5 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.5 The effect of ethanol concentration on flavonoids extraction ratio

2.2.5 螯合劑六偏磷酸鈉添加量的單因素試驗(yàn)結(jié)果

螯合劑六偏磷酸鈉的添加量的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 螯合劑添加量對(duì)提取效果的影響Fig.6 The effect of chelating agent on flavonoids extraction ratio

從圖6中可以看出，在一定范圍內(nèi)，六偏磷酸鈉添加量越高，獼猴桃皮黃酮的得率逐漸升高。當(dāng)螯合劑的添加量達(dá)到0.5%時(shí)，獼猴桃皮黃酮的得率最高，為1.485%。當(dāng)螯合劑添加量高于0.5%時(shí)，隨著螯合劑添加量的提高，獼猴桃皮黃酮的得率不但沒(méi)有提高，反而有所下降，可能是因?yàn)殡S著螯合劑添加量的增加，與樣液中的水分相結(jié)合，使樣液的極性在提取時(shí)發(fā)生變化，最后造成了提取效果不明顯，降低了黃酮的提取量。因此選取最合適的螯合劑添加量為0.5%。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取對(duì)獼猴桃皮黃酮得率影響較大的提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、螯合劑（-SH）六偏磷酸鈉添加量等4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化螯合劑輔助乙醇浸提獼猴桃皮中黃酮的工藝參數(shù)，選擇料液比1∶20（g/mL），因素水平表見(jiàn)表2。

正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

結(jié)果表明，在試驗(yàn)4中獼猴桃皮中黃酮的得率最高，即A2B1C2D3，此時(shí)的獼猴桃皮黃酮得率為1.518%。從極值大小可以看出4種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的效果為C（提取時(shí)間）〉A(chǔ)（提取溫度）〉B（乙醇濃度）〉D（螯合劑六偏磷酸鈉添加量）。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，最優(yōu)水平組合為A2B1C2D3，與通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果表中最優(yōu)水平組合試驗(yàn)4 相同，所以最優(yōu)工藝參數(shù)提取時(shí)間70 min，提取溫度80℃，乙醇濃度60%，螯合劑六偏磷酸鈉添加量0.6%。此時(shí)獼猴桃皮中黃酮的得率為1.518%。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal experimental design

表3 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

3 結(jié)論與討論

在獼猴桃皮黃酮提取的試驗(yàn)中，結(jié)果顯示添加含巰基（-SH）的螯合劑六偏磷酸鈉，可以明顯的提高黃酮的提取效果。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最終確定獼猴桃皮中黃酮的最佳提取條件為：料液比1∶20（g/mL），提取時(shí)間 70 min，提取溫度 80℃，乙醇濃度60%，螯合劑六偏磷酸鈉添加量0.6%。此時(shí)黃酮得率達(dá)到1.518%。

含巰基（-SH）的螯合劑選擇了六偏磷酸鈉，食品級(jí)六偏磷酸鈉應(yīng)用在多種食品中，如腌制肉、水果飲料、冰激凌和乳制品等。由于在提取黃酮時(shí)，螯合劑的使用量很小，在安全用量范圍內(nèi)，因此可以利用六偏磷酸鈉輔助提取黃酮，為今后獼猴桃皮的綜合利用提供理論依據(jù)。