呂小健，許引，董攀飛，徐蘭英，李士明，龍濤，*，王運(yùn)利

（1.武漢紡織大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430200；2.黃岡師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000）

陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium），為蕓香科柑桔屬植物橘（Citrus eticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，是一種傳統(tǒng)的藥食同源的材料[1]，具有燥濕化痰、理氣健脾等功效[2]?，F(xiàn)代藥理作用研究表明，陳皮中多甲氧基黃酮類成分具有抗炎[3]、抗癌[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]、抗氧化[6]等生物活性。因此，陳皮近年來(lái)被廣泛開(kāi)發(fā)為各種功能性保健食品、食用香料添加劑等[7]。

多甲氧基黃酮（polymethoxyflavones，PMFs）是柑橘種屬中所特有的黃酮類化合物[8]，在柑橘種屬果皮中含量尤為豐富，其分子空間構(gòu)型呈平面型，極性較小，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有機(jī)溶劑[9]。陳皮中多甲氧黃酮提取的傳統(tǒng)方法有索氏提取法[10]、有機(jī)溶劑提取法[11]、酶解提取法[12-13]、超聲輔助提取法[14]、微波輔助提取法等[15]，然而這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作過(guò)程繁瑣、收率較低、大量使用有機(jī)溶劑造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)。本研究運(yùn)用超臨界CO2流體萃取法，其原理是用高壓狀態(tài)下的液態(tài)CO2進(jìn)行萃取，然后減壓使CO2氣化，釋放出萃取產(chǎn)物。該提取工藝不僅總黃酮得率高，而且具有后續(xù)產(chǎn)品分離工藝簡(jiǎn)單、無(wú)溶劑污染等優(yōu)點(diǎn)。

川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮、橘皮素在陳皮中的含量較為豐富，是陳皮中3種主要多甲氧基黃酮，本文以這3種黃酮總量作為江西陳皮總多甲氧基黃酮含量指標(biāo)，通過(guò)Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法探究超臨界CO2流體萃取陳皮多甲氧基黃酮最佳工藝，為陳皮的開(kāi)發(fā)與綜合利用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮：黃州匯康藥材批發(fā)市場(chǎng)，產(chǎn)地為江西。

無(wú)水乙醇、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液態(tài)CO2（純度99.5%）黃岡大江東有限公司；川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品為催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制（已通過(guò)核磁和質(zhì)譜鑒定結(jié)構(gòu)，含量采用高效液相色譜峰面積歸一化法計(jì)算均不低于98%）。

1.2 儀器與設(shè)備

HA220-50-06 型超臨界流體萃取裝置：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；CCA-20 型低溫冷卻水循環(huán)泵、SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DS-5510DT 型超聲波清洗器：上海生析超聲儀器有限公司；BSA124S 分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LC-20A 型高效液相色譜儀：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 陳皮預(yù)處理

陳皮于烘箱中60℃條件下干燥12 h，粉碎后過(guò)40 目篩，取粗顆粒進(jìn)行萃取試驗(yàn)。

1.3.2 工藝流程

陳皮→干燥→粉碎→過(guò)篩→稱重→超臨界萃取→總黃酮萃取液→旋蒸干得到稠膏→HPLC 分析檢測(cè)，計(jì)算川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的總得率。

1.3.3 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）條件

GL Sciences Intersil C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～50 % 乙腈；15 min～20 min，50 %～70 % 乙腈；20 min～25 min，70%～85%乙腈；25 min～30 min，85%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線的繪制及其得率的計(jì)算

精密稱取0.005 0 g 川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級(jí)甲醇超聲波輔助溶解于10 mL 的容量瓶中，定容，配制成0.5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲(chǔ)備液。采用逐步稀釋法得到0.5、0.05、0.025、0.01、0.005、0.002 5 mg/mL 等一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過(guò)0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣，HPLC 檢測(cè)分析。根據(jù)濃度對(duì)峰面積繪制工作曲線，得到川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=31.719X+89.264（R2=0.999 9），按照以上方法得3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=22.683X+140143（R2=0.9995）和Y=37.632X+10.145（R2=0.9999）。

將超臨界萃取液旋蒸得稠膏并稱重（m1），取適量稠膏（m2）超聲輔助溶解于色譜甲醇，并定容到一定體積（V），HPLC 檢測(cè)，將峰面積代入工作曲線方程，得川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的濃度，再按公式（1）計(jì)算總得率：

式中：X1、X2和X3分別為稠膏中川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的濃度，μg/mL；ω 為總黃酮得率，mg/g；V 為稠膏定容后所得體積，mL；m0為陳皮原料質(zhì)量，g；m1為稠膏質(zhì)量，g；m2為取出稠膏的質(zhì)量，mg。

1.3.5 超臨界CO2萃取的單因素試驗(yàn)

在超臨界CO2流體萃取中，固定萃取分離罐Ⅰ、Ⅱ的溫度分別為45、50℃，壓力分別為6、8 MPa，在乙醇挾帶劑用量為300 mL 的條件下，以萃取得到的川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素3種黃酮總量作為總多甲氧基黃酮得率，探索萃取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min，萃取溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，萃取壓力分別為15、20、25、30、35 MPa時(shí)對(duì)陳皮中總多甲氧基黃酮得率的影響，初步確定各單因素的影響程度和最佳萃取條件。

1.3.6 總黃酮萃取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 方法，以萃取時(shí)間（A）、萃取溫度（B）和萃取壓力（C）3個(gè)因素為自變量，以總多甲氧基黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取時(shí)間對(duì)總多甲氧基黃酮萃取得率的影響

在萃取釜溫度為50℃，壓力為20 MPa，乙醇挾帶劑用量為300 mL 的條件下，萃取時(shí)間分別為30 min、60、90、120、150 min 時(shí)，分別計(jì)算總多甲氧基黃酮萃取得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 時(shí)間對(duì)總黃酮得率影響曲線圖Fig.1 Effect of time on the yield of total PMFs

由圖1可見(jiàn)，萃取時(shí)間從30 min 到90 min，總多甲氧基黃酮得率持續(xù)上升，萃取時(shí)間為90 min 時(shí)總多甲氧基黃酮得率達(dá)到最大，90 min 之后隨著萃取時(shí)間延長(zhǎng)，總多甲氧基黃酮得率不再繼續(xù)增加。這是因?yàn)檩腿傞_(kāi)始時(shí)，由于CO2流體與陳皮粉末顆粒未達(dá)到充分接觸，因而收率較低；后續(xù)隨著萃取時(shí)間延長(zhǎng)，CO2流體與陳皮顆粒混合越來(lái)越充分，傳質(zhì)速率提高，因而總多甲氧基黃酮得率快速增加；當(dāng)總多甲氧基黃酮得率達(dá)到最大值后，由于陳皮粉末顆粒中的多甲氧基黃酮成分含量大大降低，隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)，總多甲氧基黃酮得率并無(wú)明顯增加。因此，確定最佳萃取時(shí)間為90 min。

2.2 萃取溫度對(duì)總多甲氧基黃酮萃取得率的影響

在萃取釜壓力為20 MPa，萃取溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，乙醇挾帶劑用量300 mL 條件下萃取90 min，分別計(jì)算總多甲氧基黃酮萃取得率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)總黃酮得率影響曲線圖Fig.2 Effect of temperature on the yield of total PMFs

由圖2可見(jiàn)，在溫度為35℃到55℃之間，隨溫度升高，總多甲氧基黃酮得率不斷增加，55℃時(shí)得率達(dá)到最大值，之后隨溫度上升，總多甲氧基黃酮得率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響較為復(fù)雜，在一定壓力條件下，溫度升高有利于溶質(zhì)揮發(fā)和擴(kuò)散，從而使萃取得率增大；另一方面，溫度過(guò)高時(shí)超臨界流體密度降低，多甲氧基黃酮在超臨界流體中的溶解度減小，不利于萃取。綜上可確定最佳萃取溫度為55℃。

2.3 萃取壓力對(duì)總多甲氧基黃酮萃取得率的影響

固定萃取釜溫度為55℃，壓力分別為10、15、20、25、30 MPa，乙醇挾帶劑用量300 mL 條件下，萃取90 min，分別計(jì)算總多甲氧基黃酮的萃取得率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 壓力對(duì)總黃酮提取率影響曲線圖Fig.3 Effect of pressure on the yield of total PMFs

由此可見(jiàn)，壓力從10 MPa 升高到25 MPa 時(shí)，總多甲氧基黃酮得率從呈明顯上升趨勢(shì)，壓力為25 MPa 時(shí)多甲氧基黃酮得率最高，總當(dāng)壓力超過(guò)25 MPa 時(shí)，總多甲氧基黃酮萃取得率基本保持不變。這是因?yàn)檩腿囟纫欢〞r(shí)，隨壓力增加，CO2流體密度增大，溶劑的溶解能力隨之增大，因而多甲氧基黃酮萃取得率增加。但當(dāng)壓力達(dá)到一定值后，CO2流體液態(tài)性質(zhì)明顯，繼續(xù)增加壓力，流體密度及溶解能力改變較小，因而多甲氧基黃酮萃取得率變化不大。且壓力增加，操作風(fēng)險(xiǎn)增大，因此固定萃取壓力為25 MPa。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化陳皮多甲氧基黃酮萃取工藝

以萃取時(shí)間（A）、萃取溫度（B）和萃取壓力（C）為考察因素，以總多甲氧基黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示，方差分析見(jiàn)表3。

表2 萃取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of optimal response Surface for extraction process

表3 回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

續(xù)表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Regression equation analysis of variance

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design Expert 軟件對(duì)各因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到以得率為響應(yīng)值的二階線性回歸方程為：Y =1.69 +0.077A +0.16B +0.17C +0.040AB -0.037AC+0.11BC-0.21A2-0.070B2-0.23C2。

由表3可知，該回歸模型的P 值〈0.000 1，說(shuō)明回歸模型的影響達(dá)到極顯著水平；模型的失擬項(xiàng)P〉0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著。模型的總決定系數(shù)R2=0.975 3，表明該模型能解析97.53%的響應(yīng)變化，說(shuō)明該模型擬合良好。校正決定系數(shù)R2Adj=0.943 4，說(shuō)明該模型響應(yīng)值的變化有94.34%來(lái)源于所選變量。響應(yīng)值Y 的變異系數(shù)CV=4.16%〈5%，說(shuō)明試驗(yàn)的重復(fù)性良好。萃取條件的3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小順序?yàn)锳〈B〈C。一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)BC，二次項(xiàng)A2，B2影響極顯著（P〈0.01），二次項(xiàng)C2項(xiàng)影響顯著（P〈0.05）；其他因素影響不顯著（P〉0.05）。通過(guò)Design-Expert 軟件繪制萃取時(shí)間和溫度、萃取時(shí)間和壓力、萃取溫度和壓力交互作用的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 各因素兩兩交互作用影響的響應(yīng)面Fig.4 Response Surface of the interaction of various factors

由圖4b可知，總多甲氧基黃酮得率隨著萃取溫度和壓力的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，曲面較為陡峭，等高線呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明萃取溫度和壓力的交互作用極顯著（P〈0.01）；由圖4a 和4c可知，曲面較平緩，等高線呈現(xiàn)圓形，說(shuō)明萃取時(shí)間和壓力間、萃取時(shí)間和溫度間的交互作用不顯著（P〉0.01）。

2.5 響應(yīng)面條件的確定

通過(guò)Design Expert 預(yù)測(cè)分析得到陳皮中總多甲氧基黃酮的最佳萃取工藝條件為萃取時(shí)間66.9 min，溫度55℃，壓力28 MPa，得率達(dá)到1.879 mg/g。考慮到實(shí)際操作的可行性，萃取工藝參數(shù)調(diào)整為萃取時(shí)間67 min，溫度55℃，壓力28 MPa，在此條件下，做3 次平行試驗(yàn)，總多甲氧基黃酮得率為1.89 mg/g，與預(yù)測(cè)值相對(duì)偏差為0.59%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的陳皮中總多甲氧基黃酮的萃取工藝條件是可靠的。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用超臨界CO2流體萃取技術(shù)，對(duì)陳皮中的多甲氧基黃酮進(jìn)行萃取。試驗(yàn)以總多甲氧基黃酮得率為指標(biāo)，探討了時(shí)間、溫度、壓力3個(gè)條件對(duì)超臨界CO2流體對(duì)陳皮中多甲氧基黃酮萃取的影響，萃取條件對(duì)總多甲氧基黃酮得率影響大小依次為壓力、溫度和時(shí)間，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定最佳萃取條件為壓力25 MPa、溫度55℃、萃取時(shí)間為90 min。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化并結(jié)合操作可行性，得到最佳萃取工藝條件為萃取時(shí)間67 min，溫度55℃，壓力28 MPa，總黃酮得率達(dá)到1.89 mg/g。