馬丹，周淑芬，張珺，朱穎軍

(1天津醫(yī)科大學(xué)中心婦產(chǎn)科臨床學(xué)院，天津300070；2天津市第三中心醫(yī)院)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬乳多空病毒科，具有較強(qiáng)的宿主特異性，主要感染人黏膜上皮[1]。根據(jù)致癌風(fēng)險(xiǎn)，可分為低危型HPV與高危型HPV(HR-HPV)[2]，最常見HR-HPV亞型為HPV16、HPV18[3]。免疫功能異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。Th17、Treg均屬CD4+T細(xì)胞亞群，介導(dǎo)細(xì)胞因子發(fā)揮不同免疫效應(yīng)，二者存在動(dòng)態(tài)平衡，分別分泌白細(xì)胞介素17(IL-17)、白細(xì)胞介素23(IL-23)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等細(xì)胞因子[5]。有研究表明Th17/Treg失衡在宮頸感染中發(fā)揮重要作用[6]。本研究擬通過檢測(cè)陰道微環(huán)境中免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平變化，初步探討細(xì)胞因子在宮頸HR-HPV感染中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年9月～2017年6月在天津醫(yī)科大學(xué)中心婦產(chǎn)科臨床學(xué)院就診的女性患者92例，均有HR-HPV持續(xù)感染史。納入標(biāo)準(zhǔn)：有性生活史；非月經(jīng)期。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期；檢查前1周內(nèi)陰道用藥；合并非宮頸組織的其他惡性腫瘤；半年內(nèi)曾使用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑；有盆腔放化療史。根據(jù)組織病理檢查結(jié)果及參考《實(shí)用婦科腫瘤學(xué)》[7]將患者分為CIN Ⅰ級(jí)30例(A組)、CIN Ⅱ、Ⅲ級(jí)32例(B組)、宮頸癌30例(C組)。A組年齡25～50(34.62±8.11)歲，感染HPV16型12例、HPV18型10例、其他型8例。B組年齡26～52(35.16±7.62)歲，感染HPV16型13例、HPV18型12例、其他型7例。C組年齡27～51(34.27±7.38)歲，感染HPV16型10例、HPV18型11例、其他型9例。三組年齡、感染類型具有可比性。另同期選取體檢健康女性31例為對(duì)照組，經(jīng)液基薄層細(xì)胞檢測(cè)宮頸無異常，年齡23～50(32.67±5.17)歲。各組年齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情并簽署手術(shù)同意書。

1.2 HR-HPV負(fù)荷量檢測(cè) 各組自行清洗外陰，宮頸活檢前用5 mL生理鹽水沖洗宮頸及陰道上1/3，停留10 s后于后穹隆吸出灌洗液4～4.5 mL，室溫2 000 r/min離心5 min，吸取上清液于-80 ℃冷凍保存，用宮頸刷收集脫落細(xì)胞于-4 ℃保存。取宮頸脫落細(xì)胞，采用雜交捕獲2代基因雜交信號(hào)放大系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)儀器設(shè)備與試劑購(gòu)自美國(guó)Digene公司。

1.3 陰道微環(huán)境中細(xì)胞因子水平檢測(cè) 取灌洗上清液冰上解凍，恢復(fù)室溫后采用ELISA法檢測(cè)IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平。IL-17檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，IL-23檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博生物科技有限公司，IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司，TGF-β檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?；馍锟萍加邢薰尽?yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組HR-HPV感染患者病毒負(fù)荷量分布比較 三組HR-HPV負(fù)荷量分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組HR-HPV負(fù)荷量比較[例(%)]

2.2 四組陰道微環(huán)境中細(xì)胞因子水平比較 四組陰道微環(huán)境中細(xì)胞因子水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，B組、C組IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)，A組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與A組比較，B組、C組IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)；與B組比較，C組IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)。見表2。

表2 四組陰道微環(huán)境中細(xì)胞因子水平比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05。

2.3 不同亞型感染患者陰道微環(huán)境中細(xì)胞因子水平比較 不同HR-HPV亞型感染患者陰道微環(huán)境中細(xì)胞因子水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同亞型感染患者陰道微環(huán)境中細(xì)胞因子水平比較

2.4 HR-HPV感染患者陰道微環(huán)境中免疫細(xì)胞因子水平與HR-HPV負(fù)荷量的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平與HR-HPV負(fù)荷量均呈正相關(guān)(rs分別為0.612、0.513、0.597、0.519，P均<0.05)。

2.5 宮頸HR-HPV感染的影響因素 將宮頸是否感染HR-HPV作為因變量，以IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β均為宮頸HR-HPV感染的影響因素。見表4。

表4 宮頸HR-HPV感染的影響因素多元回歸分析

2.6 陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸HR-HPV感染的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制ROC曲線，陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)HR-HPV感染的ROC曲線下面積為0.731，特異度為81.2%，敏感度為76.3%。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤(rùn)癌為45～55歲，近年來有年輕化的趨勢(shì)。HR-HPV感染是CIN及宮頸癌的主要致病因素[8]。HPV感染可使上皮細(xì)胞獲得較高的增殖活性，也可通過促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖而癌變[9]，是人類癌癥發(fā)病過程中惟一確定的致癌病毒。多數(shù)婦女曾感染過HPV，大部分可經(jīng)免疫系統(tǒng)自行消除，但一旦免疫系統(tǒng)出現(xiàn)問題無法消除，導(dǎo)致宮頸病變甚至發(fā)生宮頸癌[10]。有研究表明，HR-HPV負(fù)荷量與宮頸病變程度有關(guān)，HR-HPV負(fù)荷量越高，宮頸病變加重的危險(xiǎn)越大[11]。因此，避免HR-HPV感染是降低宮頸癌發(fā)病率的關(guān)鍵。

有研究表明，免疫系統(tǒng)在宮頸HR-HPV感染中發(fā)揮重要作用，CD4+T細(xì)胞亞群接受抗原刺激后，增殖、分化為各種效應(yīng)細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，參與各個(gè)階段的免疫應(yīng)答[12]。正常機(jī)體CD4+T細(xì)胞亞群除Th1、Th2外，還包括Th17與Treg。Th17主要分泌IL-17、IL-23。Treg被認(rèn)為是一種獨(dú)立的CD4+T細(xì)胞亞群，主要功能是抑制其他T細(xì)胞的活化[13]。有研究表明，Treg細(xì)胞可通過發(fā)揮免疫抑制作用而參與HPV病毒的免疫逃逸[14]。Treg細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子IL-10和TGF-β。Th17及Treg細(xì)胞來源于相同的Th0，在特定細(xì)胞因子調(diào)控下相互排斥，向不同的方向分化[15]。但有關(guān)IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β在陰道灌洗液中的水平及其與宮頸HR-HPV感染的關(guān)系研究甚少。

徐靜等[16]研究中HR-HPV負(fù)載量隨CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)別依次增加，認(rèn)為HPV負(fù)荷量可促進(jìn)宮頸逐步發(fā)生病變。本研究隨著病情加重，HR-HPV負(fù)荷量大于1 000 copies/mL的人數(shù)逐漸增多，而小于100 copies/mL的人數(shù)逐漸減少，表明HR-HPV負(fù)荷量越大病情越重，與相關(guān)研究一致。何芳等[17]研究表明，Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞水平與宮頸癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)有關(guān)，表明Th17、Treg細(xì)胞均與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，宮頸病變患者陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平高于對(duì)照組，且隨病情加重，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，推測(cè)IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β可能參與了宮頸病變發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化。與宮頸正常者比較，宮頸癌患者IL-17/IL-6值升高，因此猜測(cè)Th17/Treg在升高的同時(shí)向Th17偏移，形成Th17優(yōu)勢(shì)；而"Th17優(yōu)勢(shì)"是造成宮頸HPV感染的重要原因之一。本研究在不同HR-HPV感染亞型中，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)楦腥緛喰头N類多，而樣本量小，無法體現(xiàn)差異。Spearman相關(guān)性分析顯示，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β均與HR-HPV負(fù)載量呈正相關(guān)，提示HPV感染會(huì)造成細(xì)胞免疫因子IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，進(jìn)一步導(dǎo)致患者免疫功能下降，使機(jī)體更易受到病毒襲擊。同時(shí)采用Logistic回歸分析結(jié)果顯示IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高是宮頸HR-HPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ROC曲線分析結(jié)果顯示四者聯(lián)合檢測(cè)，曲線下面積為0.731，敏感度、特異度良好，對(duì)宮頸HR-HPV感染具有預(yù)測(cè)價(jià)值，有望成為預(yù)測(cè)宮頸HR-HPV感染的重要指標(biāo)。

綜上所述，頸HR-HPV感染患者陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，四者聯(lián)合檢測(cè)可預(yù)測(cè)宮頸HR-HPV感染。由于本研究樣本數(shù)較少，結(jié)果有可能產(chǎn)生偏倚，將來需擴(kuò)大樣本對(duì)研究結(jié)果加以證實(shí)。