趙婷，姚吉龍，張華坤，劉慶芝

(南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院,廣東深圳 518000)

生殖醫(yī)學的發(fā)展給越來越多的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者帶來了福音。系統(tǒng)性檢查夫婦雙方的染色體、感染因素、血栓前狀態(tài)、內(nèi)分泌因素、自身免疫因素等，并針對性地治療可使部分患者成功妊娠。但仍有部分復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者通過上述檢查并未發(fā)現(xiàn)明顯異常，被稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA),推測可能與母體對胚胎父系抗原排斥有關(guān)，其治療非常棘手。有研究表明，在體外將外周血淋巴細胞加入子宮內(nèi)膜細胞中培養(yǎng)后，可以增加滋養(yǎng)細胞對子宮內(nèi)膜的侵襲力，說明自體淋巴細胞可能改善了子宮內(nèi)膜的免疫狀態(tài)[1]。目前對自體淋巴細胞體內(nèi)宮腔治療的研究甚少。本研究通過對URSA進行絨毛膜促性腺激素(HCG)培養(yǎng)自體淋巴細胞宮腔內(nèi)灌注治療，探究該方法對妊娠結(jié)局的影響；并于治療后取少量內(nèi)膜組織，檢測不同妊娠結(jié)局患者內(nèi)膜組織中白細胞介素2(IL-2)、IL-8、腫瘤壞死因子α(NF-α)、T細胞活化后表達和分泌的調(diào)節(jié)蛋白(RANTES)的水平，探究其相關(guān)機制，從而為URSA患者提供新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年9月～2017年9月就診于本院生殖綜合門診的URSA患者46例，年齡(32.15±4.08)歲，連續(xù)流產(chǎn)次數(shù)≥2次。本研究患者子宮無器質(zhì)性病變及生殖道畸形，無感染因素，無內(nèi)分泌檢查異常，無遺傳性疾病且夫婦雙方染色體檢查無異常，排除自身免疫功能紊亂。將46例患者隨機分為觀察組和對照組各23例，觀察組年齡(33.09±4.39)歲，BMI(22.33±1.63)kg/m2，子宮內(nèi)膜厚度(8.96±1.02)mm；對照組年齡(31.22±3.57)歲，BMI(22.39±1.78)kg/m2，子宮內(nèi)膜厚度(9.00±1.23)mm。兩組臨床資料具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 自體淋巴細胞分離及宮腔灌注治療方法 對照組常規(guī)進行主動免疫治療，觀察組進行自體淋巴細胞宮腔灌注治療及內(nèi)膜搔刮并取樣。連續(xù)B超監(jiān)測觀察組排卵情況，于排卵前4～5 d，抽取患者自體外周血10～20 mL，應(yīng)用淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞，并使用TCM199 (Gibco, Grand Island, NY, USA)洗滌2次后，將細胞密度調(diào)至1×106/mL，置于RPMI1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司)及10%血清白蛋白中與HCG(3～6 U/mL)混合共培養(yǎng)24 h后，離心分離出淋巴細胞。經(jīng)生理鹽水洗滌、定容，將細胞密度調(diào)整為(1～5)×108/mL,重懸至300～500 μL于5 mL無菌離心管中備用。排卵前3 d，患者取膀胱截石位，0.1%碘伏常規(guī)消毒外陰及陰道，人工授精管連接1 mL注射器，抽取分離好的淋巴細胞，緩慢注射入宮腔內(nèi)，停留幾秒鐘后取出人工授精管，患者平躺休息15～20 min。宮腔灌注2個月經(jīng)周期后指導(dǎo)患者備孕。

1.3 觀察指標 半年后比較兩組妊娠結(jié)局(持續(xù)妊娠、再次流產(chǎn)、未妊娠)。比較觀察組不同妊娠結(jié)局者的年齡、流產(chǎn)次數(shù)、BMI、子宮內(nèi)膜厚度及治療后子宮內(nèi)膜組織中IL-2、TNF-α、IL-8、RANTES水平。宮腔灌注1個周期后于黃體期，常規(guī)消毒外陰及陰道，用一次性內(nèi)膜取樣器抽取少量內(nèi)膜組織，生理鹽水洗滌，離心收集標本，后置于凍存管中(Falcon)，迅速放入液氮中，后至-80 ℃冰箱儲存?zhèn)錂z。IL-2、IL-8、TNF-α、RANTES試劑盒購自美國Bio-rad公司，按照Bio-plex操作說明書進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 兩組妊娠結(jié)局比較 觀察組持續(xù)妊娠9例、再次流產(chǎn)3例、未妊娠11例，臨床妊娠率為39.13%；對照組持續(xù)妊娠2例、再次流產(chǎn)6例、未妊娠15例，臨床妊娠率為8.69%；兩組臨床妊娠率比較P<0.05。

2.2 觀察組不同妊娠結(jié)局者一般情況比較 見表1。各組年齡、BMI、子宮內(nèi)膜厚度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

表1 觀察組不同妊娠結(jié)局者一般情況比較

2.3 觀察組不同妊娠結(jié)局者治療前后子宮內(nèi)膜組織中IL-2、TNF-α、IL-8、RANTES水平比較 見表2。

3 討論

URSA是生殖醫(yī)學領(lǐng)域的一大難題，其病因不明，復(fù)雜多樣，治療棘手[2]。URSA患者承擔著巨大的社會心理壓力，如何解決此類患者的妊娠問題，提高其妊娠率，成為臨床醫(yī)生亟待解決的問題。URSA可能與母胎間免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。胚胎攜帶父系抗原種植于子宮內(nèi)膜，相當于一種半同種移植，如果母體對胚胎父系抗原免疫低反應(yīng)，不能識別父系抗原，就會發(fā)生免疫排斥，導(dǎo)致流產(chǎn)。目前對URSA患者的治療，主要是丈夫或第三方供血的淋巴細胞主動免疫治療及靜脈注射免疫球蛋白，但其有效性至今尚存在爭議。本研究采用自體淋巴細胞宮腔灌注，避免了丈夫及第三方供血可能造成的血源性感染、過敏反應(yīng)等。且宮腔灌注直接作用于子宮內(nèi)膜局部，操作簡便，易于被患者所接受。Nakayama等[3]將外周血單核細胞(PBMC)加入小鼠胚胎的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)胚胎的侵襲作用增強;若HCG與PBMC共同孵育后再加入培養(yǎng)基中，則胚胎的侵襲作用顯著增強。表明HCG增強了PBMC的作用。HCG與外周血淋巴細胞作為妊娠期間重要的激素及免疫細胞，兩者作用相輔相成?；诖吮狙芯繉⒆泽w淋巴細胞進行預(yù)處理，將其與HCG共培養(yǎng)24 h，從而增強自體淋巴細胞對子宮內(nèi)膜局部的免疫調(diào)節(jié)作用。

表2 觀察組不同妊娠結(jié)局者治療前后子宮內(nèi)膜組織中IL-2、TNF-α、IL-8、RANTES水平比較

注：與相同妊娠結(jié)局治療前比較，*P<0.05。

Madkour等[4]對至少2次種植失敗的患者，在移植胚胎前給予已培養(yǎng)的自體外周血淋巴細胞宮腔內(nèi)治療后，患者的胚胎種植率(21.54%)及臨床妊娠率(44.44%)均顯著上升。Yu等[5]研究也表明，HCG體外培養(yǎng)自體PBMC宮腔注射后，既往有反復(fù)種植失敗的患者臨床妊娠率也明顯提高，達46.24%。目前有關(guān)宮腔灌注治療的研究主要針對反復(fù)種植失敗的患者。本研究首次對URSA患者給予宮腔灌注HCG孵育的自體淋巴細胞，同樣取得了較高的妊娠率。提示對于URSA患者,自體淋巴細胞宮腔灌注可能為一種較好的治療方法。

輔助性T淋巴細胞(Th)，又被稱為CD4+細胞，其與自然流產(chǎn)密切相關(guān)，其根據(jù)功能的差異及分泌細胞因子的不同分為Th0、Th1、Th2細胞亞群。Th0細胞是前體細胞，起主要作用的是Th1、Th2細胞。Th1細胞可分泌IL-2、IL-12、干擾素γ、TNF-α等，促使巨噬細胞、NK細胞增殖分化，通過介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，參與超敏反應(yīng)及器官特異性免疫調(diào)節(jié)，起到免疫殺傷的作用[6]。Th2細胞則可分泌IL-4、IL-6、IL-5、IL-8等細胞因子，抑制炎癥因子的生成，促進B細胞增殖分化及抗體的生成，通過體液免疫發(fā)揮免疫耐受的作用[7]。因此，要維持正常妊娠，母體免疫應(yīng)向Th2偏移，以促使母體與胚胎間免疫容受的形成[8]。IL-8為Th2細胞因子，可促進子宮內(nèi)膜血管的形成，促進胚胎著床，趨化激活中性粒細胞介導(dǎo)免疫平衡[9,10]。RANETS具有類封閉因子作用，能夠阻止母體NK細胞對同種異基因胎兒父系抗原的免疫識別及應(yīng)答，抑制混合淋巴細胞反應(yīng);妊娠過程中如果其產(chǎn)生減少，母體會將胚胎視為異物對其進行免疫攻擊，從而導(dǎo)致流產(chǎn)[11]。IL-2、TNF-α是Th2細胞產(chǎn)生的重要細胞因子，在正常早期妊娠的絨毛及間質(zhì)細胞中很少表達，IL-2可與TNF-α產(chǎn)生協(xié)同作用，激活NK細胞，促使淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化為細胞毒性細胞，產(chǎn)生免疫毒性作用[12,13]。正常情況下，胚胎為避免被母體免疫細胞排斥，應(yīng)使Th1/Th2免疫反應(yīng)處于平衡狀態(tài)，在胚胎植入及以后的懷孕過程中，母體會分泌大量Th2細胞因子，使免疫反應(yīng)向Th2轉(zhuǎn)化，以Th2型反應(yīng)為主，利于妊娠的進展[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與治療前相比，觀察組中持續(xù)妊娠者治療后IL-2、TNF-α水平下降，IL-8、RANETS水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義;而再次流產(chǎn)與未妊娠者相關(guān)細胞因子水平治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義。Th1型細胞因子減少，Th2型細胞因子增多，促使免疫反應(yīng)Th1/Th2平衡向Th2型偏移，Th2型反應(yīng)占主導(dǎo)地位，促使母胎免疫耐受的形成，從而使妊娠過程繼續(xù)進行下去。

綜上所述，HCG培養(yǎng)自體淋巴細胞宮腔灌注治療可顯著改善URSA患者的妊娠結(jié)局，其機制可能通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部細胞因子的改變，促使免疫反應(yīng)向Th2型偏移，促使母體與胎兒間免疫耐受形成，從而避免流產(chǎn)的發(fā)生。但本研究也有不足，樣本量較小，今后對其作用機制還要進行深入研究。