宋東坡，陳曉英，呂亞囡，王偉青，李文杰

(青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266034)

楓糖尿癥(MSUD)是由支鏈酮酸脫氫酶復(fù)合體(BCKD)缺乏引起的一種罕見(jiàn)常染色體隱性遺傳病。BCKD主要由支鏈酮酸脫氫酶異聚體(E1)、二氫硫辛酰胺支鏈?；D(zhuǎn)移酶(E2)和二氫硫辛酰胺脫氫酶(E3)組成。其中E1由兩個(gè)E1α和兩個(gè)E1β亞單位組成。E1α亞單位由BCKDHA基因編碼合成，E1β亞單位由BCKDHB基因編碼合成。E2由DBT基因編碼合成，E3由DLD基因編碼合成。MSUD臨床罕見(jiàn)且病死率極高。本研究分析2014年8月～2017年4月收治的5例MSUD患兒的遺傳學(xué)病因，首次報(bào)道位點(diǎn)的致病性，同時(shí)初步討論突變類(lèi)型與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒1(P1)，男，36周+4，順產(chǎn)，出生體質(zhì)量2.55 kg，出生7 d發(fā)病，表現(xiàn)為吃奶差，反應(yīng)性差；血串聯(lián)質(zhì)譜(MSMS)：總亮氨酸(LEU+ILE+PRO-OH) 1 609.43 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 32.11，纈氨酸(VAL) 28.16 μmol/L；未行尿液串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)檢測(cè)；于2歲1個(gè)月死亡。患兒2(P2)，男，40周+3，順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.08 kg，出生4 d發(fā)病，表現(xiàn)為嗜睡，嗆奶，反應(yīng)性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 2 360.96 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 104.33，VAL 351.46 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸35.7，2-酮-異戊酸5.5，2-酮-3-甲基戊酸14.3，2-酮-異己酸8.5；于出生21 d死亡?；純?(P3)，女，36周+2，剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量2.85 kg，出生6 d發(fā)病，表現(xiàn)為反應(yīng)性差，吃奶差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 2 419.1 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 49.42，VAL 688.26 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸159.1，2-酮-異戊酸90.1，2-酮-3-甲基戊酸196.6，2-酮-異己酸178.1；于出生22 d死亡?；純?(P4)，女，41周+2，順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.55 kg，出生7 d發(fā)病，表現(xiàn)為嗜睡，反應(yīng)性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 3 392.14 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 70.3，VAL 1 080.17 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸7.7，2-酮-異戊酸3.1，2-酮-3-甲基戊酸9.5，2-酮-異己酸34.2；患兒自確診后接受治療與隨訪，出生10個(gè)月，生長(zhǎng)發(fā)育落后，肌張力低，豎頭不穩(wěn)，尖足，眼神呆滯?；純?(P5)，男，38周+2，剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.5 kg，出生7 d發(fā)病，表現(xiàn)為拒乳，反應(yīng)性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 3 238.76 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 60.5，VAL 549.9 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸19.59，2-酮-異戊酸32.4，2-酮-3-甲基戊酸5.4，2-酮-異己酸7.2；患兒自確診后接受治療和隨訪，出生10個(gè)月，生長(zhǎng)發(fā)育基本正常，雙側(cè)下肢肌張力低，認(rèn)母，可逗笑，能與人交流。5例患兒父母表型均正常?；純焊改妇炇鹬橥鈺?shū)，研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 基因測(cè)序 采用二代高通量測(cè)序技術(shù)。采集患兒外周血2 mL，外送金域臨床檢測(cè)中心進(jìn)行高通量測(cè)序分析。采用QIAampDNA提取試劑盒(QIAGEN公司)抽提基因組DNA，將DNA隨機(jī)打斷純化，進(jìn)行擴(kuò)增并連接接頭序列，經(jīng)過(guò)捕獲、純化及再擴(kuò)增獲得基因文庫(kù)。針對(duì)BCKDHA的9個(gè)外顯子，BCKDHB的10個(gè)外顯子，DBT的11個(gè)外顯子、DLD的14個(gè)外顯子進(jìn)行高通量測(cè)序。檢測(cè)結(jié)果用BWA算法與GenBank BCKDHA(NM-000709)、BCKDHB(NM-183050)、DBT(NM-001918)、DLD(NM-000108)參考序列比較，獲得可疑的突變位點(diǎn)，并進(jìn)行父母驗(yàn)證證實(shí)突變來(lái)源。

1.3 突變位點(diǎn)生物學(xué)信息分析 采用PolyPhen2[1]、Mutation Taster[2]及SPANR[3]軟件預(yù)測(cè)突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的影響; SWISS-MODEL軟件建模，BCKDHA突變的模板為2bff.1.A[4]，BCKDHB突變的模板為1olx.1.B[5]。PDB軟件分析氨基酸殘基的功能變化[6]，參考PDB代碼為1X7Y[7]。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序及父母驗(yàn)證結(jié)果 結(jié)果顯示P1的BCKDHA攜帶c.940C>T及c.992dupA復(fù)合雜合突變，且分別來(lái)自患兒父母；P2的BCKDHB攜帶c.853C>T及c.1039-3C>A復(fù)合雜合突變，且分別來(lái)自患兒父母；P3的BCKDHB攜帶c.1046G>A及c.550delT復(fù)合雜合突變，且分別來(lái)自患兒父母；P4的BCKDHB攜帶c.383G>A及c.490G>A復(fù)合雜合突變，且分別來(lái)自患兒父母；P5的BCKDHB攜帶c.410C>T雜合突變，來(lái)自患兒母親。DBT和DLD未發(fā)現(xiàn)突變。其中c.1039-3C>A突變?yōu)閮?nèi)含子突變，其余突變均發(fā)生在外顯子區(qū)域。經(jīng)過(guò)檢索SNP、ExAC及1000G數(shù)據(jù)庫(kù)c.940C>T、c.853C>T、c.410C>T被ExAC收錄，具有SNP代碼；c.1046G>A具有SNP代碼；c.383G>A、c.940C>T雖被報(bào)道但未被以上數(shù)據(jù)庫(kù)收錄；c.550delT為本研究首次發(fā)現(xiàn)；c.992dupA、c.1039-3C>A為首次報(bào)道的新突變。

2.2 計(jì)算機(jī)軟件分析結(jié)果

2.2.1 突變位點(diǎn)保守性分析結(jié)果 除P2 c.1039-3C>A發(fā)生在內(nèi)含子外，其他突變均發(fā)生在高度保守的外顯子區(qū)域，見(jiàn)表1。PolyPhen2和Mutation taster兩種軟件得分越接近1越預(yù)示突變位點(diǎn)為保守位點(diǎn)，突變可能導(dǎo)致蛋白功能的改變而致??；SPANR適用于剪接錯(cuò)誤突變的預(yù)測(cè)，當(dāng)Dpsi_Percentile得分小于3分時(shí)認(rèn)為能夠引起剪接突變而致病。另外，c.940C>T和c.853C>T突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼提前終止，截短蛋白的產(chǎn)生必然發(fā)生剪接錯(cuò)誤因此Dpsi_Percentile得分偏低。

表1 5例患兒基因突變情況及軟件預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.2 建模及PBD分析結(jié)果 P1 BCKDHA基因c.940C>T導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.R314*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白比野生型減少132個(gè)氨基酸；c.992dupA導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.Y331*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少115個(gè)氨基酸。PBD二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示p.R314*改變使得編碼蛋白丟失9個(gè)α螺旋，2個(gè)β鏈和2個(gè)β轉(zhuǎn)角；p.Y331*改變使得編碼蛋白丟失8個(gè)α螺旋，1個(gè)β鏈和2個(gè)β轉(zhuǎn)角。P2 BCKDHB基因c.853C>T導(dǎo)致蛋白水平p.R285*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少108個(gè)氨基酸。二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示蛋白丟失6個(gè)α螺旋，4個(gè)β鏈。P3 BCKDHB基因c.550delT突變導(dǎo)致p.S184Pfs*46讀碼框移位，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少164個(gè)氨基酸，二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示蛋白丟失10個(gè)α螺旋、1個(gè)β轉(zhuǎn)角、11個(gè)β折疊；P3 BCKDHB基因c.1046G>A錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白水平p.C349Y改變。P4 BCKDHB基因c.383G>A 錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.G128E改變；c.490G>A錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.A164T改變。P5 BCKDHB基因 c.410C>T錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.A137V的改變。這幾個(gè)錯(cuò)義突變可能導(dǎo)致編碼產(chǎn)生的蛋白于突變位點(diǎn)之后的二級(jí)結(jié)構(gòu)丟失。

3 討論

MSUD是一種罕見(jiàn)的隱形遺傳代謝病，總體患病率約為1∶185 000，在近親婚配率較高的阿拉伯和土耳其人群MSUD患病率較高[8～10]。我國(guó)由于MSMS開(kāi)展的較晚，缺乏大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，因此具體發(fā)病率不詳。本研究青島地區(qū)篩查24萬(wàn)新生兒確診4例，門(mén)診接診外地患兒1例。MSUD的發(fā)病率雖然很低，但卻是一種嚴(yán)重威脅患者生命健康的疾病，患者由于BCKD活性完全或部分缺乏導(dǎo)致亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸在體內(nèi)蓄積，引發(fā)重度酮癥酸中毒、神經(jīng)功能損害、精神發(fā)育遲滯。2001年以前國(guó)內(nèi)外對(duì)該病遺傳學(xué)病因的研究報(bào)道認(rèn)為突變有34%發(fā)生在BCKDHA(E1α基因)基因上；29%在BCKDHB(E1β基因)基因上；24%在E2基因上；13%在E3基因上[11]。2007年德國(guó)報(bào)道的30個(gè)突變基因中，37%在BCKDHA上，46%在BCKDHB上，13%在E2基因上[12]。2013年Narayanan等[13]報(bào)道的印度南部地區(qū)發(fā)生在BCKDHA上和BCKDHB上突變均占46%，DBT基因突變占14%。由此可見(jiàn)BCKDHA和BCKDHB是MSUD患兒的主要突變基因，而E3基因的突變極為少見(jiàn)。本文報(bào)道的5例患兒中1例為BCKDHA突變導(dǎo)致，4例為BCKDHB突變導(dǎo)致，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)發(fā)病情況[14～21]，其發(fā)病基因的比例為BCKDHB占60%，BCKDHA占28%，DBT占12%，E3未見(jiàn)。

本文報(bào)道的9個(gè)突變位點(diǎn)中c.940C>T、c.853C>T、c.1046G>A、c.383G>A、c.490G>A、c.410C>T均已報(bào)道過(guò)。c.550delT位點(diǎn)為本研究首次發(fā)現(xiàn);c.992dupA、c.1039-3C>A為首次報(bào)道突變。本文重點(diǎn)討論新突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的影響。位于BCKDHA基因第7外顯子的c.992dupA突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.Y331*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少115個(gè)氨基酸。丟失的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含THDP輔助因子的連接位點(diǎn)336H[4]。由于BCKD結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性取決于THDP輔助因子和鉀離子的存在[22]，因此上述突變將明顯改變E1α以及與之相連接的E1β的空間結(jié)構(gòu)及功能。另外，由于突變導(dǎo)致編碼終止信號(hào)提前出現(xiàn)在第7外顯子上，很有可能導(dǎo)致無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(NMD)，導(dǎo)致相對(duì)明確的功能丟失[23]。c.1039-3位于BCKDHB基因上最后一個(gè)外顯子5′端的剪接位點(diǎn)受體上，突變導(dǎo)致剪接位點(diǎn)受體丟失，由于人類(lèi)剪接規(guī)律依照GU-AG規(guī)則，當(dāng)剪接位點(diǎn)受體丟失可能導(dǎo)致剪接方式發(fā)生改變從而使得外顯子變長(zhǎng)，編碼產(chǎn)生加長(zhǎng)蛋白產(chǎn)物,也可引發(fā)NMD的發(fā)生導(dǎo)致蛋白功能丟失而致病。

MSUD患兒臨床結(jié)局與BCKD的活性密切相關(guān)。75%的經(jīng)典型MSUD患者其BCKD的活性?xún)H為正常人的0～2%，因此臨床損害最為嚴(yán)重。由于缺乏BCKD活性的直接數(shù)據(jù)支持，我們初步對(duì)MSUD臨床嚴(yán)重程度與基因突變類(lèi)型的關(guān)系進(jìn)行了探討。目前MSUD嚴(yán)重程度與遺傳學(xué)病因的關(guān)系并不明確[24]。理論上，純合子突變更容易揭示突變與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，但就目前的報(bào)道來(lái)看，除了近親婚配率高的人群純合突變率較高外，大多數(shù)患者為復(fù)合雜合突變。本文的5例MSUD患兒中有4例為復(fù)合雜合突變，1例為單雜合突變。該5例患兒雖然均被診斷為經(jīng)典型MSUD,但臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度不一。5例患兒均在出生后7 d內(nèi)發(fā)病，P1血中支鏈氨基酸以亮氨酸為主，纈氨酸升高不明顯，一直在門(mén)診接受治療；2歲1個(gè)月時(shí)由于重度酸中毒昏迷家長(zhǎng)放棄治療而死亡。P2至P5血中總亮氨酸和纈氨酸水平均遠(yuǎn)高于正常水平。P2和P3雖經(jīng)過(guò)積極治療但是由于一直無(wú)法建立自主呼吸且長(zhǎng)期昏迷家長(zhǎng)放棄治療于生后20 d左右死亡。P4確診后早期進(jìn)行了規(guī)范治療但是由于家長(zhǎng)配合性差，患兒腦部磁共振檢查顯示顱內(nèi)多發(fā)異常信號(hào)神經(jīng)系統(tǒng)不可逆受損，且生長(zhǎng)發(fā)育落后。P5雖然初期腦部神經(jīng)系統(tǒng)存在異常信號(hào)但經(jīng)過(guò)規(guī)范治療及監(jiān)測(cè)，10個(gè)月大查體患兒雖雙側(cè)下肢肌張力低下，但俯臥位抬頭穩(wěn)，會(huì)逗笑，能與人交流，認(rèn)母偶有咿呀兒語(yǔ)，生長(zhǎng)發(fā)育基本正常。P1至P3臨床損害嚴(yán)重，分析其基因突變類(lèi)型發(fā)現(xiàn)3例患兒均存在翻譯提前終止的突變，截短蛋白及NMD機(jī)制的發(fā)生，導(dǎo)致mRNA降解，BCKD活性完全缺失可能是臨床損害嚴(yán)重的機(jī)制。P5雖僅檢測(cè)到一個(gè)雜合突變c.410C>T，但是結(jié)合患者血串聯(lián)結(jié)果、尿GC-MS結(jié)果和臨床表現(xiàn)診斷為經(jīng)典型MSUD。Nellis等[25]曾報(bào)道攜帶c.410C>T突變的淋巴細(xì)胞BCKD無(wú)活性，根據(jù)MSUD的遺傳規(guī)律不排除該患兒存在其他致病突變。一代測(cè)序以及MLPA技術(shù)可以進(jìn)一步針對(duì)內(nèi)含子和缺失重復(fù)突變進(jìn)行檢測(cè)幫助尋找遺傳學(xué)病因。MSUD多發(fā)于新生兒，早期診斷早期干預(yù)對(duì)提高患兒生命質(zhì)量至關(guān)重要[26]。

本研究選擇5例MSUD病例，并分析了新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)的致病性，明確了MSUD患兒的遺傳學(xué)病因。此5例MSUD病例突變基因的報(bào)道有利于世界MSUD基因熱點(diǎn)突變的統(tǒng)計(jì)，同時(shí)新位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)豐富了BCKDHA基因和BCKDHB基因的突變譜，為MSUD的診斷和治療以及產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。