王妍妍，段紅艷，劉曉雯，閔子謙，李 丹

(湖南大學(xué)生物學(xué)院，中國湖南長(zhǎng)沙410082)

多種因素會(huì)誘發(fā)男性生殖系統(tǒng)障礙，使得精子發(fā)生異常，最終嚴(yán)重影響男性的生育能力。研究表明，患有隱睪癥、畸形精子癥、精索靜脈曲張、睪丸扭轉(zhuǎn)等疾病的男性，其睪丸組織常伴隨高水平的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，而高濃度的ROS也會(huì)影響男性生殖系統(tǒng)的正常運(yùn)作[1]。以隱睪癥為例，男性睪丸中的生殖細(xì)胞需要在溫度略低于體溫的陰囊內(nèi)才可以正常發(fā)育，而隱睪癥患者睪丸被滯留在腹股溝管內(nèi)或腹腔內(nèi)，使睪丸處于相對(duì)高溫環(huán)境，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，導(dǎo)致精子發(fā)生受阻，以致患者生育力降低甚至失去生育能力[2～4]。再如，在畸形精子癥患者的睪丸組織中，高水平的ROS所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物等不斷積累，抗氧化系統(tǒng)受損，進(jìn)而導(dǎo)致精子畸形，阻礙精子發(fā)生過程[5]。以上研究事實(shí)表明，ROS可能對(duì)睪丸生殖疾病的發(fā)生發(fā)展過程起到一定的促進(jìn)作用。

精子發(fā)生是精原干細(xì)胞的增殖與分化過程，該過程依賴于生精小管內(nèi)的支持細(xì)胞以及周圍的間質(zhì)細(xì)胞的共同協(xié)作[6]。其中，睪丸支持細(xì)胞是精子發(fā)生過程中的一種重要細(xì)胞，既可以分泌乳酸為精子細(xì)胞提供物質(zhì)支持，又可以通過細(xì)胞間相互連接形成血睪屏障為精子發(fā)生提供結(jié)構(gòu)保障。支持細(xì)胞的損傷會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生異常[7～8]。研究表明，ROS不僅影響精子細(xì)胞，也影響睪丸微環(huán)境中的其他類型細(xì)胞，例如支持細(xì)胞[9]。

近年來大量研究證明，氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的ROS能誘導(dǎo)自噬發(fā)生[10]。自噬普遍存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，一般情況下處于較低水平，主要維持細(xì)胞的自我更新;當(dāng)受到外界環(huán)境刺激(如饑餓、營養(yǎng)缺乏、氧脅迫等)時(shí)，自噬水平升高，使細(xì)胞在應(yīng)激條件下能循環(huán)利用營養(yǎng)物質(zhì)，利于細(xì)胞存活。但是自噬水平過高時(shí)，會(huì)因過度“吞噬”胞內(nèi)物而造成細(xì)胞死亡[11～13]。研究證實(shí)，隱睪癥患者睪丸組織表現(xiàn)出生精細(xì)胞凋亡增加[14]，而細(xì)胞自噬作為程序性細(xì)胞死亡的另一種類型，與細(xì)胞凋亡在功能上存在聯(lián)系。例如:凋亡途徑Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白質(zhì)(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)可以與自噬相關(guān)蛋白ATG5(autophagy-related protein 5)相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡;凋亡調(diào)控蛋白FLICE樣抑制蛋白質(zhì)(Fas-associated deathlike IL-1β -convening enzyme inhibitory protein，F(xiàn)LIP)既可與ATG3蛋白結(jié)合抑制自噬形成，也可抑制死亡受體5/6(death receptor 5/6，DR5/6)而抑制凋亡[15～16]。這揭示自噬與凋亡有共同的調(diào)節(jié)因素和信號(hào)調(diào)控交匯點(diǎn)，同時(shí)參與一些生理與病理過程。因此，探討自噬在隱睪癥以及畸形精子癥等不育疾病中的作用機(jī)制具有重要的意義。

本研究利用高通量的qPCR array技術(shù)，篩選了可能參與隱睪性不育的自噬相關(guān)基因，并分別以小鼠支持細(xì)胞系TM4和精原細(xì)胞系GC-1 spg為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)過氧化氫(H2O2)處理后，通過噻唑藍(lán)(MTT)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化，最后利用GEO數(shù)據(jù)庫分析自噬相關(guān)基因與其他不育癥例如畸形精子癥的關(guān)系。通過綜合比較，最終篩選出BCL2L1、EIF2AK3基因可能與男性不育相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 臨床組織樣本和細(xì)胞系

5例隱睪癥患者及5例正常人的睪丸組織的石蠟包埋切片樣品來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院病理科。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過湖南大學(xué)生物學(xué)院倫理委員會(huì)的認(rèn)可。

小鼠睪丸支持細(xì)胞系TM4(ATCC?CRL-1715)和小鼠精原細(xì)胞系GC-1 spg(ATCC?CRL-2053)由本實(shí)驗(yàn)室保存。兩種細(xì)胞系均在含10%胎牛血清(Gibco BRL，美國)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL，美國)中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

噻唑藍(lán)(MTT)(沈陽萬類生物科技有限公司);RNAiso Plus總RNA抽提試劑(TaKaRa公司，日本);PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司，日本);Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation(Invitrogen 公司，美國);TransScript?Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);AceQ?SYBR?Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司);H2O2(Sigma公司，美國);SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司，日本)。

1.3 石蠟包埋組織切片樣品總RNA的抽提以及逆轉(zhuǎn)錄

將總厚度約80 μm的石蠟組織切片置于1.5 mL離心管中，加入1 mL 100%二甲苯，50℃水浴加熱3 min，然后離心棄二甲苯。按照Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation說明書提取石蠟包埋組織切片樣本中的總RNA，利用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度，并注意RNA純度(1.7＜OD260/OD280＜2.0 即認(rèn)為 RNA 純度良好)。按照TransScript?Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作。

1.4 qPCR array篩選

qPCR array是運(yùn)用高通量熒光定量PCR進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選的技術(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA分批次進(jìn)行96孔qPCR array實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)44種自噬相關(guān)基因在隱睪癥患者睪丸組織和正常睪丸組織中的表達(dá)差異。以人源管家基因 β-actin 為內(nèi)參，sense:5′GCACCACACCTTCTACAATGAG3′;antisense:5′ACAGCCTGGATGGCTACGT3′。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，所有基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各自噬相關(guān)基因引物序列如表1所示。反應(yīng)體系如下:AceQ?SYBR?Green Master Mix(Low ROX Premixed)5 μL;正向引物(10 μmol/L)0.2 μL;反向引物(10 μmol/L)0.2 μL;模版 cDNA 1 μL;滅菌水3.6 μL。反應(yīng)程序設(shè)置:95℃ 5 min;95℃ 5 s，60℃ 30 s;95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用MxPro QPCR、Minitab 17軟件進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞氧化應(yīng)激處理及MTT檢測(cè)

每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中培養(yǎng)過夜;采用不同濃度(0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L)的 H2O2處理細(xì)胞8 h。小心吸棄上清，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，避光條件下37℃孵育4 h;吸棄MTT培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，搖床中速振蕩 15 min;酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品OD值，記錄OD值并重復(fù)實(shí)驗(yàn)(單個(gè)實(shí)驗(yàn)組有5個(gè)復(fù)孔;單個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)3次)[17]。根據(jù)下面公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.6 細(xì)胞內(nèi)總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

將細(xì)胞接種于6孔板，37℃培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，分別用不同濃度H2O2(0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L)處理 TM4 細(xì)胞和 GC-1 spg細(xì)胞8 h。小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，然后吹打數(shù)次，最后收集至1.5 mL離心管中。按照RNAiso Plus總RNA抽提試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)RNA的提取;按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用日本TaKaRa公司的SrBR?Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作:cDNA 1 μL;SYBR?PremixEx TaqTMⅡ12 μL;ROXⅡ 0.5 μL;上下游引物各1 μL，最后加滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序設(shè)置:95℃，30 s;95℃，5 s;58℃，30 s;72℃，30 s，循環(huán)數(shù)40。以小鼠的管家基因GAPDH為內(nèi)參，sense:5′AGGTCGGTGTGAACGGATTTG3′;antisense:5′CCGTGAGTGGAGTCATACTGGAA3′。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，11個(gè)差異表達(dá)的鼠源自噬相關(guān)基因引物序列如表2所示，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.8 生物信息學(xué)分析

進(jìn)入GEO DataSets(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)，以“畸形精子癥(teratozoospermia)”為關(guān)鍵詞，以“expression profiling by array”為條件，檢索與男性畸形精子癥相關(guān)的數(shù)據(jù)集，得到GDS2697 DateSets;然后在該數(shù)據(jù)庫中檢索11個(gè)差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，并通過制圖軟件GraphPad Prism 6繪制成箱線圖。所有數(shù)據(jù)做3次以上的平行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均源自3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，利用t-檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。**P＜0.01，表示與對(duì)照組比較結(jié)果具有極顯著性差異;*P＜0.05，表示與對(duì)照組比較結(jié)果具有顯著性差異，P＞0.05表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果沒有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 qPCR array方法篩選與隱睪性不育癥相關(guān)的自噬相關(guān)基因

采用高通量的qPCR array方法，分別檢測(cè)44個(gè)自噬相關(guān)基因在5例正常人睪丸組織和5例隱睪組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，熱圖結(jié)果如圖1A所示。圖1B為篩選出的11個(gè)差異表達(dá)基因的箱線分布圖，其中表達(dá)上調(diào)的基因共有7個(gè):ATG2A、BAK1、BCL2L1、BID、EIF2AK3、BNIP3、mTOR; 表 達(dá) 下 調(diào)的基因有 4 個(gè):TRAF6、ATG2B、BAX、Casp3。

2.2 GC-1 spg細(xì)胞中H2O2氧化應(yīng)激對(duì)自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了探討氧化應(yīng)激對(duì)精原細(xì)胞活性的影響，采用不同濃度(0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L)的 H2O2處理小鼠精原細(xì)胞GC-1 spg 8 h。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L H2O2組相比，細(xì)胞存活率隨處理濃度的增加而呈現(xiàn)依賴性降低，當(dāng)H2O2濃度為80 μmol/L、100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率分別降至62%、58%(圖2A)，表明細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。基于此，我們選取 0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L的H2O2開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 44個(gè)自噬相關(guān)基因的引物序列(人源)Table 1 Primer sequences of 44 autophagy-related genes(human)

提取氧化處理后GC-1 spg細(xì)胞的RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)上述11種差異表達(dá)基因在H2O2處理后的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2B～D所示，不同濃度的H2O2處理GC-1 spg后，表達(dá)下調(diào)的基因有:ATG2A、BID、BAK1、mTOR、Casp3;表達(dá)上調(diào)的基因有:EIF2AK3、TRAF6、BNIP3;在低濃度H2O2處理時(shí)上調(diào)而高濃度H2O2處理時(shí)表達(dá)下調(diào)的基因有:ATG2B、BCL2L1;沒有明顯變化的基因有:BAX。

表2 11個(gè)自噬相關(guān)基因的引物序列(鼠源)Table 2 Primer sequences of 11 autophagy-related genes(mouse)

圖1 44個(gè)自噬相關(guān)基因在人正常睪丸組織和隱睪組織標(biāo)本中的表達(dá)水平分析(A)qPCR array檢測(cè)44個(gè)自噬相關(guān)基因表達(dá)水平的熱圖分析;(B)11個(gè)差異基因在隱睪組織和正常睪丸組織中表達(dá)水平的箱線圖。S:樣本;N:正常睪丸組織，C:隱睪組織;*P＜0.05。Fig.1 The expression of 44 autophagy-related genes in testicular tissues of patients with cryptorchidism and healthy fertile men(A)The hot graph analysis of 44 autophagy-related genes detected by qPCR array;(B)Box plot of 11 differentially expressed genes in cryptorchidism and normal testicular tissue.S:Sample.N:Normal testicular tissue;C:Testicular tissue of cryptorchidism.*P＜0.05.

2.3 TM4細(xì)胞中H2O2氧化應(yīng)激對(duì)自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激對(duì)睪丸支持細(xì)胞活性的影響，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度(0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L)的H2O2處理小鼠TM4支持細(xì)胞8 h。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L H2O2組比較，細(xì)胞存活率隨處理濃度的增加而呈現(xiàn)依賴性降低，當(dāng)H2O2濃度為80 μmol/L、100 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率降至 20%左右(圖3A)，說明細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制?；诖?，選取 0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L的H2O2開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

提取氧化處理后TM4細(xì)胞的RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄，隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)外源性H2O2處理TM4細(xì)胞后11個(gè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3B～D所示，表達(dá)下調(diào)的基因有:ATG2A、BAK1、BID、BNIP3、BAX;隨著處理濃度增加而上調(diào)的基因有:EIF2AK3、Casp3、mTOR、BCL2L1、TRAF6、ATG2B。

2.4 GEO數(shù)據(jù)庫檢索分析自噬相關(guān)基因與畸形精子癥發(fā)生的相關(guān)性

GDS2697是關(guān)于男性畸形精子癥的數(shù)據(jù)分析集組，共21個(gè)樣本，包括正常男性精子細(xì)胞樣本13個(gè)，男性不育的畸形精子細(xì)胞樣本8個(gè)。通過對(duì)該數(shù)據(jù)庫中11個(gè)差異表達(dá)基因的分析發(fā)現(xiàn)，在畸形精子細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因有:ATG2A、ATG2B、mTOR、Casp3;表達(dá)上調(diào)的自噬相關(guān)基因有:BNIP3、BAX、BCL2L1、BID、EIF2AK3;TRAF6、BAK1無明顯變化(圖4)。

表3綜合顯示了11個(gè)差異表達(dá)基因在隱睪組織、畸形精子細(xì)胞以及兩種氧化應(yīng)激細(xì)胞系中(此處選取 0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L H2O2處理后的基因表達(dá)水平進(jìn)行總體比較)的表達(dá)情況。通過比較自噬相關(guān)基因在隱睪癥、畸形精子癥和H2O2處理的GC-1 spg細(xì)胞系中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的基因有Casp3;表達(dá)上調(diào)的基因有 BNIP3、EIF2AK3、BCL2L1。而在隱睪癥、畸形精子癥和H2O2處理的TM4細(xì)胞系中，表達(dá)上調(diào)的基因有:EIF2AK3、BCL2L1。綜合以上分析可知，EIF2AK3、BCL2L1在兩種病理狀態(tài)下以及氧化應(yīng)激過程中均表達(dá)上調(diào)。

3 討論

圖2 GC-1 spg細(xì)胞中氧化應(yīng)激對(duì)11個(gè)自噬相關(guān)基因表達(dá)水平的影響(A)MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率;(B～D)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)11個(gè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平。*P＜0.05;**P＜0.01。Fig.2 The effect of oxidative stress on the expression of 11 autophagy-related genes in GC-1 spg cells(A)CellsurvivalratedetectedbyMTT;(B～D)The expression of11 autophagy-related genesdetectedbyqRT-PCR.*P＜0.05;**P＜0.01.

圖3 TM4細(xì)胞中氧化應(yīng)激對(duì)11個(gè)自噬相關(guān)基因表達(dá)水平的影響(A)MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率;(B～D)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)11個(gè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平。*P＜0.05;**P＜0.01。Fig.3 The effect of oxidative stress on the expression of 11 autophagy-related genes in TM4 cells(A)Cell survival rate detected by MTT;(B～D)The mRNA expression of 11 autophagy-related genes detected by qRT-PCR.*P＜0.05;**P＜0.01.

圖4 11個(gè)自噬相關(guān)基因與畸形精子癥發(fā)生的相關(guān)性分析Fig.4 The correlation analysis between 11 autophagy-related genes and teratozoospermia

隱睪癥是常見的先天性發(fā)育畸形性疾病，未降入陰囊的睪丸受激素、溫度和基因等因素的影響，出現(xiàn)精子發(fā)生受阻和生殖細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致男性不育常見的病因[18]。Wei等[19]在氟他胺(flutamide)誘導(dǎo)的大鼠隱睪模型中發(fā)現(xiàn)，藥物誘導(dǎo)的隱睪動(dòng)物的生育能力顯著下降，精子數(shù)量明顯減少，精子畸形率增加，睪酮減少，睪丸組織形態(tài)嚴(yán)重?fù)p傷。在本研究中，我們通過高通量qPCR array方法，檢測(cè)了44個(gè)自噬相關(guān)基因在隱睪癥患者和生育力正常人睪丸組織中的表達(dá)差異，共篩選出差異表達(dá)基因11個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的自噬相關(guān)基因共 7 個(gè):ATG2A、BAK1、BCL2L1、BID、EIF2AK3、BNIP3、mTOR;表達(dá)下調(diào)的基因有4個(gè):TRAF6、ATG2B、BAX、Casp3(圖 1)。該結(jié)果表明，隱睪癥患者的生殖細(xì)胞在凋亡過程中存在著自噬相關(guān)基因的表達(dá)異常。

表3 11個(gè)自噬相關(guān)基因在兩種病理和細(xì)胞氧化應(yīng)激狀況下的表達(dá)趨勢(shì)Table 3 Expression of 11 autophagy-related genes under two pathological conditions and cellular oxidative stress

研究表明，隱睪癥患者體內(nèi)常常伴隨較高的ROS水平，使睪丸處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而引起睪丸生精功能障礙[18～20]。本研究通過外源H2O2誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞系TM4和精原細(xì)胞系GC-1 spg發(fā)生氧化應(yīng)激后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)從細(xì)胞水平檢測(cè)了11個(gè)差異基因的表達(dá)水平，其中表達(dá)上調(diào)的基因有4個(gè):ATG2B、BCL2L1、EIF2AK3、TRAF6;表達(dá)下調(diào)的基因有3個(gè):ATG2A、BID、BAK1(表3)。結(jié)果表明在氧化應(yīng)激狀況下，各自噬相關(guān)基因?qū)ρ趸瘧?yīng)激的反應(yīng)不同。

近年有研究發(fā)現(xiàn)，自噬在支持細(xì)胞中參與了外質(zhì)特化結(jié)構(gòu)的組裝，支持細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的缺失會(huì)引起外質(zhì)特化結(jié)構(gòu)組裝異常，從而使精子頭部不能正確塑形，最終導(dǎo)致畸形精子癥的發(fā)生[21～22]。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫分析了11個(gè)差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因與畸形精子癥的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)基因在畸形精子癥中表達(dá)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)，該結(jié)果表明畸形精子癥中存在自噬相關(guān)基因的表達(dá)異常。通過綜合分析，我們發(fā)現(xiàn)BCL2L1、EIF2AK3在隱睪癥、畸形精子癥和氧化應(yīng)激條件下GC-1 spg和TM4細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)一致，均表現(xiàn)為上調(diào)，提示這兩個(gè)基因在精子發(fā)生與睪丸病理改變過程中扮演重要的角色。

BCL2L1，又被稱為BCL-X，是BCL2家族成員，具有抗凋亡作用。在早期的神經(jīng)發(fā)育過程中，BCL-X基因編碼的蛋白質(zhì)作為神經(jīng)元存活率的調(diào)節(jié)因子而發(fā)揮作用[23]。BCL-X對(duì)雄性小鼠生育力具有重要作用，在BCL-X基因敲除的雜合子雄性小鼠中，其生殖細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致睪丸發(fā)育不全，生殖能力下調(diào);而BCL-X敲除后的雌性小鼠的生殖力卻無顯著變化[24]，提示BCL-X在兩種性別中調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞凋亡的能力是不同的。在本研究結(jié)果中，BCL2L1在隱睪癥、畸形精子細(xì)胞以及兩種氧化應(yīng)激細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，提示該基因可能參與調(diào)控生殖細(xì)胞的凋亡過程。

EIF2AK3，又被稱為PERK，編碼一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的I型跨膜蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)屬于elF2α上游激酶家族中的一個(gè)成員。EIF2AK3蛋白作為一種激酶，可以通過磷酸化eIF2α來阻止蛋白質(zhì)合成，也可調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2是PERK蛋白的作用底物，在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞可以通過PERK/Nrf2相互作用通路發(fā)揮抗氧化功能[25]。越來越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過程會(huì)刺激自噬發(fā)生，該應(yīng)激反應(yīng)中的EIF2AK3蛋白激酶信號(hào)通路可以促進(jìn)自噬相關(guān)基因表達(dá)，激活細(xì)胞自噬，進(jìn)而通過自噬過程降解一些受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等，促進(jìn)細(xì)胞存活[26～29]。

綜上所述，本研究通過對(duì)臨床標(biāo)本以及氧化應(yīng)激條件下小鼠精原細(xì)胞系GC-1 spg和支持細(xì)胞系TM4中自噬相關(guān)基因的篩選與分析，最終篩選出可能與男性不育相關(guān)的基因BCL2L1和EIF2AK3，為進(jìn)一步探索氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下的自噬與睪丸生殖疾病發(fā)生之間的關(guān)系提供了一定的研究思路。