張 靈，劉 秘，王雯雯，葉嘉星，方周溪，王慧利，周志明，艾為明*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，中國浙江溫州325000;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，中國浙江溫州325000)

三氯生(2，4，4’-三氯均二苯脲，triclosan，TCS)是國際公認(rèn)的高效廣譜抗菌劑，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑以及日常護理用品(pharmaceuticals and personal care products，PPCPs)等領(lǐng)域，是常見的PPCPs污染物之一[1～2]。TCS具有易沉積性和生物富集作用，在河流的藻體、魚體甚至人類孕婦的血清中均有檢出[3～5];此外，它是一種穩(wěn)定的親脂性化合物，易被人體皮膚和口腔黏膜吸收，存在于人體各種組織和體液中[6]。TCS的高脂溶性及生物蓄積性，使其能通過食物鏈逐級富集、遷移，最終在動物和人體內(nèi)蓄積而危及健康[2]。

環(huán)境中低劑量的TCS長期作用于水生生態(tài)系統(tǒng)會引發(fā)慢性致毒效應(yīng)，并可通過生物富集作用放大“積累毒性”，或與多種藥物在環(huán)境中產(chǎn)生協(xié)同作用，影響水生生物的生存，危害人類的健康，是人們最容易忽視的環(huán)境威脅之一[7]。已有研究表明，TCS對魚類、無脊椎動物、兩棲類生物的發(fā)育有急性或長期慢性暴露毒性，TCS暴露可干擾激素調(diào)節(jié)和脂肪代謝，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等[6，8]。最近有許多報道指出TCS具有潛在的神經(jīng)毒性，但是對眼部的影響尚不明確[9～10]。斑馬魚(Danio rerio)是一類具有高度視覺的物種，廣泛用于視覺系統(tǒng)發(fā)育、解剖、生理和分子生物學(xué)的研究[11]。其視網(wǎng)膜與哺乳動物(包括人類)的結(jié)構(gòu)非常相似，分層排列，包括神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮層。神經(jīng)視網(wǎng)膜具有特征性的3個細(xì)胞層，含7種主要細(xì)胞(包括6種神經(jīng)元和Muller’s膠質(zhì)細(xì)胞)。其感光細(xì)胞與人類具有相似的形態(tài)學(xué)特點，有胞體和盤狀的外節(jié)盤。斑馬魚眼部表達(dá)的5種視蛋白，均位于感光細(xì)胞的外節(jié)盤[12～13]?；谝陨涎芯勘尘埃緦嶒炌ㄟ^透射電鏡觀察暴露于TCS中斑馬魚的眼部各層細(xì)胞發(fā)育的畸變情況，以探究TCS暴露對斑馬魚眼部組織結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚親本選用健康野生型AB品系斑馬魚，購于中國科學(xué)院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center，CZRC)。雌雄魚分開飼養(yǎng)于斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，光周期為14 L(light):10 D(dark)，水溫 27.0±1 ℃，電導(dǎo)率保持在550±50 μS，pH 為 7.5±0.5，溶解氧 95%飽和，成年魚每天飼喂兩次豐年蝦。

1.2 主要試劑

文中采用的試劑主要有三氯生(TCS，美國Sigma公司)、丙酮(阿拉丁公司)和2.5%戊二醛(Solarbio公司)等。

1.3 主要儀器

SZX7體視顯微鏡(Olympus公司，日本);AE-2000倒置生物顯微鏡(Motic公司);日立E-1010離子濺射儀(日立公司，日本);Power Tome-XL型超薄切片機(RMC公司，美國);H-7500型透射電子顯微鏡(日立公司，日本)等。

1.4 胚胎收集

產(chǎn)卵前一晚將健康斑馬魚成魚按雌雄比例1︰1置于交配缸中，中間隔以透明隔板并黑暗處理10 h。次日早上8點抽去隔板使雌雄追尾產(chǎn)卵，并觀察產(chǎn)卵情況。產(chǎn)卵行為約30 min結(jié)束，隨后收集胚胎并將其轉(zhuǎn)移到含有胚胎培養(yǎng)液(embryo culture medium，ECM;配比成分見表1)的無菌培養(yǎng)皿中，做好標(biāo)記，置于恒溫培養(yǎng)箱(光周期為14 L︰10 D，溫度28.5±0.5℃)培養(yǎng)。每日更換培養(yǎng)液并及時去除死胚胎、脫下的殼膜及其他雜物。

1.5 斑馬魚胚胎暴露實驗

將較低濃度的TCS-丙酮溶液和丙酮按不同比例溶于ECM中配置暴露液。選取發(fā)育至6 hpf(受精后小時數(shù))的健康胚胎，將其置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板中，每孔一枚，使胚胎暴露于TCS梯度濃度(0.4 mg/L，0.6 mg/L，0.8 mg/L，1.0 mg/L，1.2 mg/L，1.4 mg/L)暴露液中，每組設(shè)有20枚胚胎，每個濃度設(shè)置2個平行組，并設(shè)有空白對照(溶液中只含ECM，無丙酮)和助溶劑對照(丙酮對照組)，每個孔中加入200 μL暴露液。加入暴露液和胚胎后，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板用封口膜封好，放到光照恒溫培養(yǎng)箱(光周期為14 L︰10 D，溫度28.5±0.5℃)培養(yǎng)。實驗期間采取換水式培養(yǎng)方法，即每天更換一次暴露液，每次更換150 μL。

實驗開始后，在設(shè)定的時間點(t=12 hpf、24 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf、120 hpf、144 hpf)用體式顯微鏡觀察對照組和實驗組中胚胎的孵化、畸形與死亡情況，并統(tǒng)計各組的死亡率和孵化率。兩個對照組的死亡率均不超過5%，否則重新進(jìn)行實驗。

表1 胚胎培養(yǎng)液的成分以及配制方法Table 1 Compositions and methods for preparing ECM

1.6 透射電鏡樣品的制備

按照參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行透射電鏡樣品的制備，主要操作步驟如下:根據(jù)前期實驗所得到的144 hpf半數(shù)致死濃度，設(shè)置TCS梯度濃度(0.1 mg/L，0.2 mg/L，0.4 mg/L)暴露液組及空白對照、助溶劑對照，每組設(shè)有20枚胚胎;連續(xù)暴露至144 hpf，取存活的斑馬魚幼魚置于自制的蠟板上，采用“雙刀切割法”快速剖取幼魚眼部組織，并于4℃預(yù)冷的固定液中修成1 mm3大小，PBS(phosphate buffered saline)緩沖液漂洗后，2.5%戊二醛固定過夜;0.1 mol/L PBS沖洗15 min后，室溫下于1%鋨酸中固定1 h;隨后，0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗15 min，醋酸鈾染色液染色，50%、70%、80%、90%、100%(Ⅰ、Ⅱ)的丙酮脫水各 10 min;浸透以及包埋聚合后，半薄切片(2 μm)進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，并進(jìn)行光鏡觀察定位;最后，將超薄切片(70 μm)置于銅網(wǎng)上，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色。實驗采用日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察視網(wǎng)膜各層并照相記錄[8～9]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理以及圖表的制作采用SPSS 18.0軟件和GraphPad Prism 6軟件，統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，統(tǒng)計學(xué)差異用SPSS 18.0軟件進(jìn)行回歸分析、方差分析，顯著性分析的P值定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 TCS對斑馬魚幼魚生長發(fā)育的影響

將斑馬魚胚胎用不同濃度的TCS暴露液培養(yǎng)至144 hpf，實驗結(jié)果如圖1所示，兩個對照組胚胎發(fā)育正常，各時期胚胎或幼魚死亡率均低于5%，說明胚胎質(zhì)量滿足后續(xù)實驗要求。暴露培養(yǎng)至48 hpf時，1.4 mg/L TCS暴露組的胚胎死亡率約為30%;暴露培養(yǎng)至96 hpf后，該組胚胎全部死亡。暴露至144 hpf時，兩個對照組幼魚全部存活，0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L、1.2 mg/L和1.4 mg/L TCS暴露組的死亡率分別為5%、5%、70%、80%、90%和100%。此外，兩個對照組胚胎在48 hpf時開始孵化，72 hpf后基本孵化完全;而1.0 mg/L、1.2 mg/L和1.4 mg/L實驗組中均存在大量胚胎未孵化。由統(tǒng)計分析可知，斑馬魚幼魚死亡率與TCS暴露時間和暴露濃度呈正相關(guān)性。由回歸分析得出，96 hpf-LC50為1.048 mg/L(P＜0.05)，144 hpf-LC50為 0.782 mg/L(P＜0.05)。實驗結(jié)果表明，TCS暴露會影響斑馬魚胚胎/幼魚的孵化率、死亡率，并且隨著濃度的升高，死亡率越高，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

2.2 TCS暴露對斑馬魚眼部組織超微結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步研究TCS暴露對斑馬魚幼魚眼部結(jié)構(gòu)的影響，本實驗分別在10 000×和20 000×透射電子顯微鏡下觀察暴露144 hpf后幼魚眼部組織的超微結(jié)構(gòu)。

2.2.1 TCS暴露對斑馬魚眼部感光細(xì)胞的影響

如圖2所示，兩個對照組斑馬魚眼部的感光細(xì)胞有外節(jié)盤形成，數(shù)量較多，排列整齊(圖2，A1和B1)，感光細(xì)胞外節(jié)盤層狀結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，未見層狀結(jié)構(gòu)松散(圖2，A2和B2)，且附近的線粒體數(shù)量較多，體積較大，形態(tài)完好，未見線粒體空泡(圖2，A1～B3)。各TCS暴露組幼魚眼部感光細(xì)胞雖然也有外節(jié)盤形成(圖2，C1～E3)，但是數(shù)量較對照組少，排列松散;外節(jié)盤層狀結(jié)構(gòu)松散，呈空泡化;色素層細(xì)胞與外節(jié)盤間出現(xiàn)吞噬現(xiàn)象，邊緣空隙明顯。同時，0.2 mg/L和0.4 mg/L TCS實驗組中外節(jié)盤與色素層出現(xiàn)明顯的腫脹、空泡現(xiàn)象(圖2，D2和E2)。此外，隨著TCS暴露濃度的升高，感光細(xì)胞外節(jié)盤附近的線粒體數(shù)量相對減少，出現(xiàn)明顯的腫脹和空泡化，并有結(jié)構(gòu)溶解現(xiàn)象(圖2，D3 和 E3)，而且 0.4 mg/L TCS 暴露組的視桿細(xì)胞和色素上皮之間甚至出現(xiàn)類似外節(jié)的膜樣物質(zhì)異常堆積。

圖1 TCS暴露至144 hpf對斑馬魚胚胎和幼魚的影響Fig.1 Effects of TCS exposure on zebrafish embryos and larvae during 144 hours post-fertilization

2.2.2 TCS暴露對斑馬魚眼部外網(wǎng)狀層和內(nèi)網(wǎng)狀層的影響

如圖3所示，兩個對照組斑馬魚眼部的外網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量較多，外網(wǎng)狀層較厚(圖3，A1和A2);0.1 mg/L TCS實驗組外網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)較完整，數(shù)量較多，排列較整齊，但是部分突觸出現(xiàn)腫脹空泡(圖3，A3);0.2 mg/L TCS實驗組外網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)不完整，數(shù)量減少，排列較疏松，出現(xiàn)大量空泡(圖3，A4);0.4 mg/L TCS實驗組外網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)散亂，數(shù)量明顯減少，排列無規(guī)律，外網(wǎng)狀層較對照組明顯變薄，突觸連接部位高度腫脹，空泡化嚴(yán)重(圖 3，A5)。

與外網(wǎng)狀層的觀察結(jié)果類似，兩個對照組斑馬魚眼部的內(nèi)網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量較多，且內(nèi)網(wǎng)狀層較厚(圖3，B1和B2);0.1 mg/L TCS實驗組內(nèi)網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)與對照相比無較大差異，部分突觸出現(xiàn)腫脹、空泡現(xiàn)象(圖3，B3);0.2 mg/L TCS實驗組內(nèi)網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)不完整，數(shù)量減少，排列較疏松，出現(xiàn)大量空泡(圖3，B4);0.4 mg/L TCS實驗組內(nèi)網(wǎng)狀層突觸結(jié)構(gòu)散亂，數(shù)量明顯減少，排列無規(guī)律，內(nèi)網(wǎng)狀層較對照組明顯變薄，突觸連接部位高度腫脹，空泡化嚴(yán)重(圖3，B5)。

圖2 TCS暴露至144 hpf時斑馬魚眼部感光細(xì)胞的透射電鏡觀察A1～E1:10 000×視野;A2～E3:對應(yīng)組圖1中a、b所指位置的20 000×視野。a:感光細(xì)胞外節(jié)盤;b:線粒體;c:空泡。Fig.2 Transmission electron microscope observation of zebrafish eye photoreceptor after TCS exposure for 144 hpfA1～E1:Visual field of 10 000 times;A2～E3:20 000 times field of view at the position indicated by “a” and “b” in corresponding group figure 1.a:The photoreceptor outer segment;b:Mitochondrion;c:Vacuolar.

2.2.3 TCS暴露對斑馬魚眼部外核層細(xì)胞的影響

如圖4所示，兩個對照組斑馬魚眼部外核層細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，可觀察到3種不同類型細(xì)胞核且細(xì)胞核形態(tài)完好，未見細(xì)胞核固縮的現(xiàn)象(圖4，A和B);0.1 mg/L TCS實驗組外核層細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)固縮現(xiàn)象，同時細(xì)胞核之間出現(xiàn)明顯的間隙，染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮(圖4C);0.2 mg/L TCS實驗組外核層細(xì)胞的細(xì)胞核同樣出現(xiàn)固縮的現(xiàn)象，染色質(zhì)出現(xiàn)高度濃縮(圖4D);0.4 mg/L TCS實驗組外核層細(xì)胞的細(xì)胞核固縮現(xiàn)象更嚴(yán)重，細(xì)胞核染色質(zhì)高度濃縮，且部分出現(xiàn)溶解的現(xiàn)象(圖 4E)。

3 討論

近年來多項研究報道表明TCS的大量使用會導(dǎo)致很多的健康問題，例如:微生物抗性、皮膚刺激、內(nèi)分泌紊亂、免疫反應(yīng)、甲狀腺激素代謝改變以及癌癥等[15～18]。與其他新興污染物不同，TCS未被重視為化學(xué)污染物，這導(dǎo)致TCS在各種家用產(chǎn)品中廣泛使用，從而導(dǎo)致其在水生和陸地環(huán)境中濃度增加。本研究結(jié)果表明TCS暴露對斑馬魚胚胎和幼魚均具有較強的致畸、致死效應(yīng)，且毒性效應(yīng)與其濃度密切相關(guān)。在本研究中，暴露于1.0 mg/L、1.2 mg/L、1.4 mg/L TCS的胚胎在48 hpf和72 hpf出現(xiàn)了明顯的孵化延遲，這與Elodie等[19]報道的結(jié)果一致，提示隨著TCS濃度的增加，斑馬魚胚胎孵化率和幼魚存活率均降低。

圖3 TCS暴露至144 hpf時斑馬魚眼部外網(wǎng)狀層和內(nèi)網(wǎng)狀層的透射電鏡觀察A:外網(wǎng)狀層;B:內(nèi)網(wǎng)狀層。白色方框:網(wǎng)狀層觀察部位;箭頭:空泡。Fig.3 Transmission electron microscope observation of zebrafish eye outer and inner plexiform layers after TCS exposure for 144 hpfA:Outer plexiform layers;B:Inner plexiform layers.White box:Observation site of plexiform layer;Arrow:Vacuolar.

圖4 TCS暴露至144 hpf時斑馬魚眼部外核層的透射電鏡觀察A:空白對照組;B:丙酮對照組;C:0.1 mg/L TCS暴露組;D:0.2 mg/L TCS暴露組;E:0.4 mg/L TCS暴露組。Nm:核膜;Ch:核染色質(zhì);a:細(xì)胞核間隙;b:核固縮。Fig.4 Transmission electron microscope observation of zebrafish eye outer nuclear layer after TCS exposure for 144 hpfA:Blank group;B:Acetone group;C:0.1 mg/L TCS exposure group;D:0.2 mg/L TCS exposure group;E:0.4 mg/L TCS exposure group.Nm:Nuclear membrane;Ch:Chromatin;a:Nuclear space;b:Pyknosis of nucleus.

有研究發(fā)現(xiàn)，TCS暴露會誘導(dǎo)斑馬魚幼魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)生凋亡，影響CNS的結(jié)構(gòu)，并減少軸突密度和長度;而且，TCS暴露下發(fā)育的斑馬魚的體型縮短，頭部結(jié)構(gòu)畸形，眼睛的尺寸隨TCS濃度增加而減小[10]。斑馬魚早期眼球占身體比例較大，便于形態(tài)學(xué)研究和發(fā)育過程觀察。其視覺系統(tǒng)發(fā)育迅速，受精后24 h，眼部主要器官原基基本形成;受精后3 d，視杯、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)即可發(fā)育成熟，細(xì)胞種類和神經(jīng)細(xì)胞突觸也基本建立，并開始對光反應(yīng);受精后5 d，視覺系統(tǒng)具有功能性[20]。近年來，包括白內(nèi)障、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜疾病、年齡相關(guān)性黃斑變性在內(nèi)的多種眼疾病均已建立斑馬魚生物模型，大規(guī)模遺傳突變篩選也鑒定了一批特定眼睛表型的突變體[13]。因此，本研究在評價TCS毒理學(xué)效應(yīng)時，模擬環(huán)境中魚類眼部與TCS的接觸環(huán)境，通過透射電鏡觀察斑馬魚眼部各層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步了解TCS暴露對斑馬魚眼部組織結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響。透射電鏡結(jié)果顯示，低濃度TCS暴露時斑馬魚幼魚眼部感光細(xì)胞中大多數(shù)核染色較深，少數(shù)核皺縮甚至固縮;隨著藥物濃度的升高，感光細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，外節(jié)、內(nèi)節(jié)均變薄，排布紊亂，外節(jié)盤層狀結(jié)構(gòu)混亂，出現(xiàn)卷曲，大量外節(jié)盤與色素層細(xì)胞出現(xiàn)吞噬現(xiàn)象;對照組內(nèi)網(wǎng)狀層神經(jīng)終末空泡少，突觸復(fù)合體數(shù)量多，突觸小泡豐富，而TCS暴露組內(nèi)網(wǎng)狀層軸突內(nèi)線粒體腫脹、空化，樹突終末微管溶解，突觸稀少，突觸小泡稀少。

同時，TCS暴露組感光細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮并聚集于核膜邊緣，臨近核孔消失，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征。根據(jù)文獻(xiàn)[21]可知，隨著感光細(xì)胞的退變，其與雙極細(xì)胞之間連接的突觸大量減少，外網(wǎng)狀層逐漸變薄、中斷甚至消失。值得注意的是，雖然此時雙極細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量沒有明顯變化，但其線粒體高度膨脹，線粒體嵴斷裂或消失。因此，我們推測感光細(xì)胞作為視覺傳入的光感受細(xì)胞，其退變引起輸入成分消失，導(dǎo)致下一級神經(jīng)元(包括雙極細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞)的部分細(xì)胞器在早期發(fā)生異常，從而發(fā)生跨神經(jīng)元變性，影響斑馬魚視覺形成。

綜上所述，本研究通過對TCS暴露下斑馬魚幼魚眼部的超微結(jié)構(gòu)的觀察表明，TCS對斑馬魚早期眼部發(fā)育有一定的毒性作用。感光細(xì)胞數(shù)量減少，內(nèi)、外網(wǎng)狀層逐漸變薄，表明視網(wǎng)膜神經(jīng)元之間連接減少，影響了視網(wǎng)膜的正常功能。線粒體腫脹，可見空泡狀線粒體，表明感光細(xì)胞內(nèi)線粒體功能嚴(yán)重受損，影響了遞質(zhì)合成及釋放，進(jìn)而干擾視覺信號傳遞，甚至累及整個神經(jīng)元。電鏡觀察還發(fā)現(xiàn)突觸稀少、突觸囊泡減少等現(xiàn)象，表明TCS對神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)具有直接破壞作用?？傊?，本研究首次初步評價了TCS對斑馬魚早期眼部發(fā)育的影響，為今后眼部疾病的機制以及TCS毒性效應(yīng)的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。