曾妍靜，沈文濤，庹德財，黎小瑛，言 普*，周 鵬*

(1.海南大學熱帶農(nóng)林學院，中國海南?？?70228;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，中國海南海口571101)

DNA分子克隆技術(shù)是在分子生物學研究中廣泛使用的基礎(chǔ)技術(shù)[1]。目前，常用的酶切連接克隆、Gateway克隆、Gibson克隆等方法存在受限位點多或價格昂貴等問題[2～5]。因此，本實驗室開發(fā)了一種新的簡單快速的克隆方法，命名為Nimble Cloning。該技術(shù)的核心是在目標載體的克隆位點處設計Sfi I-ccdB-Sfi I結(jié)構(gòu)(NC克隆框)，這樣與此結(jié)構(gòu)側(cè)翼具有20 bp左右重疊序列(接頭)的目標DNA在Nimble Mix反應液作用下可直接與環(huán)狀質(zhì)粒完成克隆反應[6]。根據(jù)Nimble Cloning的工作原理，將現(xiàn)有表達載體改造為該系統(tǒng)配套的載體，只需要將NC克隆框插入到克隆位點處即可，并且改造一次可永久使用。但Sfi I為Nimble Cloning系統(tǒng)的受限位點，如果載體中含有Sfi I位點，需要將Sfi I位點突變?nèi)コ?/p>

在植物學研究領(lǐng)域常用的表達載體包括瞬時表達載體和雙元表達載體(含T-DNA)[7]。我們分析發(fā)現(xiàn)植物瞬時表達載體不含Sfi I位點，常用的植物雙元表達載體中，pGreen系列不含Sfi I位點，而pCambia系列含有5個Sfi I位點[8～9]，改造難度相對較大。因此，本項目試圖從pCambia系列載體入手，將它們改造為Nimble Cloning系統(tǒng)的載體，解決Nimble Cloning系統(tǒng)中載體改造的最大障礙。

由于pCambia系列載體的5個Sfi I位點均位于STA(stabilization)和replication origin區(qū)域，與質(zhì)粒在農(nóng)桿菌的穩(wěn)定性和復制有關(guān)，所以需要分析對載體的改造是否影響其在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性。本實驗通過多次傳代，利用菌液PCR鑒定改造質(zhì)粒是否能在農(nóng)桿菌中穩(wěn)定存在，并且使用Nimble Cloning的方法在改造后的載體中插入GFP(green fluorescent protein)基因，再使用農(nóng)桿菌注射法在本氏煙草葉片中瞬時表達，研究5個Sfi I位點的突變是否對基因表達產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體

實驗中所使用的大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans5α和DB3.1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101和pCambia1304質(zhì)粒由實驗室自備。

1.1.2 供試植物

野生型本氏煙草(Nicotiana benthamiana)種植于25℃溫室，用于農(nóng)桿菌注射的瞬時表達研究。

1.1.3 主要試劑

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix、phusion酶、普通 Taq酶Premix Taq(Taq version 2.0)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自TaKaRa公司(日本);SfiⅠ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司(美國);Nimble Cloning反應液購自海南壹田生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

SfiⅠ酶切位點識別序列是GGCCNNNNNGGCC。利用Verctor NTI Advance軟件分析發(fā)現(xiàn)pCambia1304載體上有5個SfiⅠ酶切位點，分別位于 3 623、4 057、4 066、5 332、5 644 這 5 個位置。通過堿基替換突變?nèi)コ齋fiⅠ酶切位點的方法在這5個位置上設計上下游引物(表1)。引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2.2 片段擴增

以本實驗室保存的pCambia1304質(zhì)粒為模板，利用phusion酶，分別用引物對M1Sfi I F、M2Sfi I R和引物對M2Sfi I F、M3Sfi I R以及引物對 M3Sfi I F、M4Sfi I R進行 PCR，擴增目的DNA 片段 M1、M2、M3。PCR 反應體系為 50 μL:25 μL phusion 酶，上、下游引物各 1 μL，0.2 μL pCambia1304質(zhì)粒，22.8 μL ddH2O。PCR 反應程序:98℃預變性30 s;[98℃變性8 s，55℃退火25 s，72℃延伸25 s]×30個循環(huán);72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用凝膠回收試劑盒對目的片段M1、M2、M3進行膠回收。

表1 引物列表Table 1 Primer sequences

1.2.3 pCambia1304的位點突變

將回收的3個不含SfiⅠ酶切位點的片段M1、M2、M3 與原始 pCambia1304 混合，利用Nimble Cloning技術(shù)使3個片段克隆到pCambia1304并替換相應的含有Sfi I位點的片段(圖1)。反應體系為3個片段各20 ng，pCambia1304原始載體 50 ng，Nimble Mix 5 μL，共 10 μL 反應體系，50℃反應1 h。將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans5α，然后挑取單菌落進行菌液PCR鑒定，把PCR初步鑒定為陽性克隆的菌液送往英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，使用表1中的引物進行進一步測序驗證。對于測序結(jié)果正確的5個SfiⅠ位點均突變的載體，我們將其命名為pMCambia1304。

1.2.4 pMCambia1304在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性

通過電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的方法，將質(zhì)粒pMCambia1304轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中，涂布于含卡那霉素和利福平的LB平板上，28℃培養(yǎng)兩天。從平板上隨機挑取8個單菌落進行菌液PCR鑒定，挑出陽性克隆，劃線傳代5次并做菌液PCR鑒定，分析pMCambia1304在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性。

1.2.5 pMCambia1304在植物中的表達

分析pMCambia1304質(zhì)粒的序列，在NcoⅠ和PmlⅠ這兩個酶切位點的位置，分別設計上、下游引物MCa-NC F和MCa-NC R(表1)，引物的序列由Nimble Cloning配套的通用接頭序列和與pMCambia1304質(zhì)粒有20 bp重疊的重疊序列組成，使用Nimble Cloning配套的NC克隆框片段為模板，PCR擴增MCa-NC片段，再經(jīng)電泳回收。使用NcoⅠ酶和PmlⅠ酶對pMCambia1304質(zhì)粒進行酶切，并通過Pre-Nimble Mix將MCa-NC片段與酶切后的pMCambia1304片段進行拼接，從而把NC克隆框插入pMCambia1304質(zhì)粒中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DB3.1，然后進行菌液PCR鑒定以及測序分析，序列正確的質(zhì)粒命名為pNC-Cam1304-35S。利用GFP-NC F和GFPNC R(表1)擴增GFP基因，獲得的GFP片段與pNC-Cam1304-35S混合，使用Nimble Cloning技術(shù)將GFP基因片段克隆到pNC-Cam1304-35S中。Nimble Cloning反應體系:2 μL GFP片段，3 μL pNC-Cam1304-35S質(zhì)粒，5 μL Nimble Cloning反應液，50℃，1 h。重組質(zhì)粒pNC-Cam1304-35SGFP經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中待用。使用NcoⅠ和PmlⅠ對原始pCambia1304質(zhì)粒進行酶切，并通過Pre-Nimble Mix將GFP片段與酶切后的pCambia1304進行拼接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)鑒定獲得pCambia1304-35S-GFP質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中待用。使用農(nóng)桿菌注射接種的方法[10]分別將pNC-Cam1304-35S-GFP和pCambia1304-35S-GFP注射本氏煙草的葉片，2～3 d后利用熒光顯微鏡檢測表達。

1.2.6 其他pCambia系列載體的SfiⅠ位點突變

將其他pCambia系列載體改造成適用于Nimble Cloning系統(tǒng)的載體，只需使用引物對M1Sfi I F、M4Sfi I R，以 pMCambia1304 為模板，擴增突變后的片段，再將需要改造的載體與突變后的片段混合，使用Nimble Mix便能將突變后的片段與Sfi I位點的片段互換，得到不含Sfi I位點的載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCambia1304的位點突變

圖1 pCambia1304的Sfi I位點突變示意圖Fig.1 Schematic diagram of Sfi I mutation in pCambia1304

使用引物對M1Sfi I F、M2Sfi I R和引物對M2Sfi I F、M3Sfi I R 以及引物對 M3Sfi I F、M4Sfi I R擴增的3個不含SfiⅠ位點的片段的長度分別為 M1:471 bp、M2:1 295 bp、M3:343 bp，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，能夠在對應的位置得到目的條帶(圖2A)。通過Nimble Cloning技術(shù)將片段M1、M2、M3 與原始 pCambia1304 中含 SfiⅠ位點的相應片段進行替換，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，隨機挑取6個單菌落進行初步的菌液PCR鑒定，鑒定出5個陽性克隆(圖2B)。從這5個陽性克隆中挑取1個對其改造區(qū)域進行測序鑒定，并與原始pCambia1304的序列進行比對分析，結(jié)果顯示在原先SfiⅠ酶切位點的位置各有一個堿基突變，表明pCambia1304中的5個SfiⅠ酶切位點已成功突變。

圖2 pMCambia1304載體構(gòu)建和鑒定的電泳結(jié)果(A)不含SfiⅠ位點的M1、M2、M3片段的擴增結(jié)果;(B)大腸桿菌菌液PCR鑒定。M:DNA marker DL2000;泳道1～6:隨機挑取的6個單菌落的鑒定結(jié)果。Fig.2 Construction and identification of pMCambia1304 plasmid(A)Amplification result of M1，M2，and M3 fragments without SfiⅠlocus;(B)PCR identification with E.coli solution.M:DNA marker DL2000;Lanes 1～6:Six randomly selected single colonies.

2.2 pMCambia1304穩(wěn)定性分析

將質(zhì)粒pMCambia1304轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，傳代5次，使用引物對M1Sfi I F、M2Sfi I R進行菌液PCR，鑒定該質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中能否穩(wěn)定存在。PCR電泳結(jié)果顯示鑒定的8個菌落中均有目標條帶(圖3)，表明質(zhì)粒pMCambia1304能夠在農(nóng)桿菌中穩(wěn)定存在，5個Sfi I位點的突變對質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性和復制沒有影響。

2.3 pMCambia1304的表達情況分析

在pMCambia1304質(zhì)粒中插入NC克隆框，得到pNC-Cam1304-35S質(zhì)粒。使用Nimble Cloning的方法將GFP基因片段插入pNC-Cam1304-35S中，獲得pNC-Cam1304-35S-GFP，再通過農(nóng)桿菌注射接種煙草，以未突變的pCambia1304-35S-GFP作為對照，通過熒光顯微鏡觀測GFP的表達情況。研究結(jié)果如圖4，pNC-Cam1304-35SGFP和pCambia1304-35S-GFP均有較強的熒光表達，且兩者間沒有明顯區(qū)別，表明pCambia1304載體中5個Sfi I位點的突變對其介導的基因在植物中的表達沒有影響。

圖3 pMCambia1304質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中的菌液PCR鑒定結(jié)果M:DNA marker DL2000;泳道1～8:隨機挑取的8個單菌落的鑒定結(jié)果;+、-:正、負對照。Fig.3 PCR identification of pMCambia1304 plasmid in AgrobacteriumM:DNA marker DL2000;Lanes 1～8:Eight randomly selected single colonies;+and-:The positive and negative controls.

圖4 pNC-Cam1304-35S-GFP和pCambia1304-35SGFP 的表達情況(標尺:50 μm)Fig.4 ExpressionofpNC-Cam1304-35S-GFPandpCambia1304-35S-GFP(scale bar:50 μm)

2.4 其他pCambia系列載體的Sfi I位點突變

將其他pCambia系列載體改造成適用于Nimble Cloning系統(tǒng)的載體，只需使用引物對M1Sfi I F、M4Sfi I R，以 pMCambia1304 為模板，擴增突變后的片段，再將需要改造的載體與突變后的片段混合，使用Nimble Cloning將突變后的片段與Sfi I位點的片段互換，即可得到不含Sfi I位點的改造后載體(圖5)。本研究以pCambia2301為例，將pCambia2301與突變后的片段混合，進行Nimble Cloning反應，然后在轉(zhuǎn)化后的平板中挑選6個單菌落進行測序鑒定，結(jié)果顯示6個菌落的Sfi I位點均成功突變，表明該方法用于pCambia系列載體改造具有高效性。

圖5 其他pCambia系列載體的Sfi I位點突變原理圖Fig.5 Schematic diagram of other pCambia series plasmids with Sfi I locus mutation

3 討論

Nimble Cloning是一種新型的DNA分子克隆技術(shù)，但目前該克隆技術(shù)的配套載體較少。將現(xiàn)有表達載體改造為該技術(shù)配套的載體，只需要將NC克隆框插入到克隆位點處即可，但如果載體中含有SfiⅠ位點，需要先將SfiⅠ位點突變?nèi)コ?。植物雙元表達載體pCambia系列的載體骨架含有5個SfiⅠ位點，是改造難度最大的一類載體。本研究成功將pCambia1304中的5個SfiⅠ位點進行了突變，并發(fā)現(xiàn)5個SfiⅠ位點突變不影響載體在農(nóng)桿菌中的復制和穩(wěn)定性以及在植物中的表達，為Nimble Cloning系統(tǒng)的配套載體改造清除了一大障礙。以突變后的載體pMCambia1304為模板，可以方便地擴增獲得含5個SfiⅠ突變位點的片段，將該片段與pCambia系列載體混合，再利用Nimble Cloning反應即可快速方便地獲得突變后的pCambia系列載體(圖5)。因此，本研究為其他pCambia系列載體改造成Nimble Cloning系統(tǒng)載體提供了模板和參考。

此外，本研究通過農(nóng)桿菌注射煙草瞬時表達GFP發(fā)現(xiàn)，改造后的載體pMCambia1304不影響基因的表達。該過程中GFP基因是通過Nimble Cloning技術(shù)直接克隆到配套載體pNC-Cam1304-35S中，克隆反應中質(zhì)粒pNC-Cam1304-35S不需要先酶切線性化處理，而是直接使用環(huán)狀載體，反應過程簡單、快速，為Nimble Cloning技術(shù)的應用提供了一個實例。