劉亞平，李 鑫，郭子琦，2，李曉玉，吳 瓊，2，周祖平，2，楊 程，2*

(1.廣西師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院;b.生物醫(yī)學(xué)研究中心，中國廣西桂林541004;2.廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室，中國廣西桂林541004)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類健康，我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率分別占全球的23.7%和30%[1]。大量的研究表明，免疫細(xì)胞和其產(chǎn)生的炎癥因子可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并幫助腫瘤逃避免疫監(jiān)視[2～3]。髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群未成熟但具有免疫抑制能力的髓系細(xì)胞[4～5]。在機(jī)體發(fā)生惡性腫瘤的情況下，骨髓內(nèi)的MDSCs大量擴(kuò)增，隨后與惡性細(xì)胞相遇，或通過循環(huán)系統(tǒng)被招募到實體瘤處，成為腫瘤微環(huán)境的主要成分之一[6]。近年來，免疫療法逐漸發(fā)展為腫瘤治療的熱點。深入透徹地了解各免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)生過程中的變化和作用，有可能通過改變腫瘤發(fā)生的“土壤”來抑制腫瘤的發(fā)展。因此，理想的腫瘤靶向治療不僅是針對腫瘤細(xì)胞，還要能減緩MDSCs的增殖或促進(jìn)其凋亡[7]。

目前，代謝調(diào)節(jié)已成為免疫治療領(lǐng)域的熱點。代謝水平與細(xì)胞所處的狀態(tài)密切相關(guān)，適當(dāng)?shù)哪芰抗┙o是細(xì)胞功能得以正常發(fā)揮的基礎(chǔ)[8]。近年來，針對腫瘤細(xì)胞能量代謝的研究受到了廣泛的關(guān)注[9]，然而，對于腫瘤進(jìn)程中MDSCs能量代謝的特點并不清楚。本研究旨在闡明腫瘤發(fā)生中MDSCs能量代謝的方式和2-脫氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)改變糖代謝水平后對MDSCs存活能力的影響。這不僅將提升人們對腫瘤狀態(tài)下MDSCs能量代謝特點的認(rèn)識，還能為靶向能量代謝治療腫瘤的方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗動物為C57BL/6品系小鼠(6～8周齡)，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司(SCXK(湘)2011-0003)。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung carcinoma，LLC)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫。70 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(cat:430166)、40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)(cat:2289735)均購自康寧公司，1 mL無菌注射器購自北侖河醫(yī)療技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

紅細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國);Gr-1-APC、CD-11b-PE-Cy7(eBioscience公司，美國);2-DG(MCE中國皓元生物醫(yī)藥科技有限公司);小鼠乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，ACA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);Mito Tracker Deep Red FM線粒體遠(yuǎn)紅色熒光探針(上海翊圣生物科技有限公司);細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、周期檢測試劑盒(美國 Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.1.3 儀器

流式細(xì)胞分析儀(FACS Vaerse，美國Becton Dickinson公司);多用途臺式高速冷凍離心機(jī)(LABOFUGE 400R，美國 Thermo Fisher Scientific公司);恒溫CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 240i，美國Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠肺癌模型的構(gòu)建

從液氮中取出凍存的LLC細(xì)胞，在恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸LLC細(xì)胞，于小鼠左腋皮下接種(注射濃度為2.5×106cells/mL)。對照組腋下注射等量的PBS。由于PBS是磷酸鹽緩沖液，注射給小鼠即為正常生理條件，可以跟腫瘤條件形成對照。4周后取荷瘤(腫瘤直徑約1.5 cm)小鼠和對照組的正常小鼠用于實驗。

1.2.2 骨髓單細(xì)胞的分離與制備

斷頸處死小鼠，將小鼠浸泡于75%的乙醇中1 min，剪取后腿骨頭，分離出股骨和脛骨，用1 mL注射器吸取DMEM培養(yǎng)基將骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞沖洗出來，用移液器反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，4℃、300 g離心7 min。去上清，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液后吹打均勻，裂解2 min，加入PBS終止裂解。經(jīng)40 μm細(xì)胞篩過濾至新的15 mL離心管中，4℃、300 g離心5 min后去上清，加入PBS重懸待用。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析髓源性抑制細(xì)胞的豐度

取1.2.2中制備的骨髓單細(xì)胞懸液1 mL于2 mL離心管中，300 g離心5 min，去上清，4℃避光孵育熒光偶聯(lián)抗體Gr-1(anti-mouse Gr-1-APC)和CD-11b(anti-mouse CD11b-PE-Cy7)30 min。孵育結(jié)束后洗滌細(xì)胞，加入PBS重懸以用于流式分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析髓源性抑制細(xì)胞的周期

取1.2.2中制備的骨髓單細(xì)胞懸液2 mL，300 g離心5 min后棄上清，4℃避光孵育Gr-1和CD11b抗體30 min。使用周期檢測試劑盒分析MDSCs的周期，先加入200 μL固定破膜液，充分混勻，4℃避光孵育60 min。取出離心管分別加入1 mL的破膜滲透液，輕輕吹打使其充分混勻，800 g離心5 min。去上清，室溫條件下避光孵育7-氨基放線菌素 D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)30 min。孵育完成后800 g離心5 min，去上清，加入PBS重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.2.5 髓源性抑制細(xì)胞的乙酰輔酶A含量分析

用Gr-1和CD11b熒光抗體標(biāo)記MDSCs，用流式細(xì)胞分選儀分選細(xì)胞。收集分選的MDSCs，用PBS稀釋細(xì)胞懸液，使其達(dá)到1×106cells/mL。通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破裂并釋放出細(xì)胞內(nèi)成分。600 g離心20 min，收集上清，利用小鼠乙酰輔酶A(ACA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測其乙酰輔酶A含量。

1.2.6 髓源性抑制細(xì)胞的線粒體質(zhì)量分析

取1.2.2中制備的骨髓單細(xì)胞懸液1 mL，300 g離心5 min后棄上清，4℃避光孵育Gr-1和CD11b抗體 30 min，再加入 200 μL Mito Tracker Deep Red工作液(200 nmol/L，37℃預(yù)熱)，37℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后加入1 mL的PBS，300 g離心5 min，去除上清液，加入1 mL PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測線粒體質(zhì)量。

1.2.7 2-脫氧-D-葡萄糖干預(yù)糖代謝途徑

挑選8只腫瘤直徑約1.5 cm的小鼠，每組4只，一組為實驗組，尾靜脈注射2-DG工作液(0.5 g/kg);另一組為對照組，尾靜脈注射PBS溶液。注射3 d后用于實驗。

1.2.8 細(xì)胞凋亡檢測

使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分析MDSCs的凋亡水平，首先用ddH2O將10×binding buffer稀釋成1×binding buffer。取骨髓單細(xì)胞懸液，加1 mL 1× binding buffer重懸細(xì)胞，300 g離心 5 min，去上清。用 100 μL 1× binding buffer重懸細(xì)胞，再加5 μL annexinⅤ，室溫避光孵育15 min。孵育結(jié)束后用 1×binding buffer清洗細(xì)胞。用 200 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，再加5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)避光孵育5 min。每個樣品加0.5 mL PBS混勻細(xì)胞，進(jìn)行流式檢測。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗，統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，顯著性水平為P＜0.05。采用Adobe Illustrator CS6計算機(jī)軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤進(jìn)程中髓源性抑制細(xì)胞豐度的變化

為分析腫瘤進(jìn)程中小鼠MDSCs(Gr-1+CD11b+)的豐度變化，本研究分別從正常小鼠和荷瘤小鼠中提取骨髓細(xì)胞，標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，荷瘤狀態(tài)下MDSCs的豐度顯著高于正常生理狀態(tài)下MDSCs的豐度(圖1B)，具體的統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表1。

表1 髓源性抑制細(xì)胞的豐度Table 1 Abundance of MDSCs

2.2 腫瘤進(jìn)程中髓源性抑制細(xì)胞增殖活性改變

為分析腫瘤進(jìn)程中小鼠骨髓MDSCs的增殖活性是否改變，本實驗利用7-AAD檢測荷瘤小鼠的MDSCs是否脫離靜息態(tài)進(jìn)入細(xì)胞分裂期。結(jié)果顯示，相比正常小鼠，荷瘤小鼠MDSCs進(jìn)入分裂期(S/G2/M)的比例增加(圖2)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。與細(xì)胞豐度的檢測結(jié)果一致，腫瘤進(jìn)程中MDSCs進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞比例增加，細(xì)胞分裂活躍。

表2 髓源性抑制細(xì)胞的周期時相分布Table 2 Phase distribution of the cell cycle of MDSCs

圖1 腫瘤進(jìn)程中MDSCs豐度的變化(A)編號1、2、3為荷瘤小鼠(實驗組)，編號4、5、6為正常小鼠(對照組);(B)MDSCs豐度分析的代表性流式分析圖。N-MDSC代表正常小鼠的MDSCs，T-MDSC代表荷瘤小鼠的MDSCs，MDSCs:Gr-1+CD11b+。Fig.1 Changes in cell abundance of MDSCs during tumor progression(A)Tumor-bearing mice numbered 1，2 and 3(experimental group)，and normal mice numbered 4，5 and 6(control group);(B)Representative flow chart of MDSC abundance analysis.N-MDSC represents MDSCs in normal mice，and T-MDSC represents MDSCs in tumor-bearing mice.MDSCs:Gr-1+CD11b+.

圖2 腫瘤進(jìn)程中MDSCs周期的變化Fig.2 Changes in the cell cycle of MDSCs during tumor progression

2.3 腫瘤進(jìn)程中髓源性抑制細(xì)胞的乙酰輔酶A含量檢測

腫瘤進(jìn)程中MDSCs的增殖活性明顯增加，MDSCs需要獲取更多的能量來維持其細(xì)胞活性。線粒體氧化磷酸化是細(xì)胞獲取能量的主要糖代謝方式，因此我們通過檢測乙酰輔酶A含量來確定腫瘤條件下MDSCs的氧化磷酸化水平是否發(fā)生改變。由統(tǒng)計結(jié)果可知，腫瘤狀態(tài)下MDSCs的乙酰輔酶A含量顯著高于正常生理狀態(tài)下MDSCs的乙酰輔酶A含量(表3)。

2.4 腫瘤進(jìn)程中髓源性抑制細(xì)胞的線粒體變化

線粒體是氧化磷酸化反應(yīng)的主要場所，通過流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體質(zhì)量，可以進(jìn)一步驗證腫瘤進(jìn)程中MDSCs氧化磷酸化水平的變化。Mito Tracker Deep Red FM是一種細(xì)胞滲透型的carbocyanine-based的遠(yuǎn)紅外紅色熒光探針，包含標(biāo)記線粒體的弱巰基反應(yīng)性的氯甲基官能團(tuán)，能直接聚集在活性線粒體上。根據(jù)正常小鼠和荷瘤小鼠Mito Tracker Deep Red熒光強(qiáng)度的比較結(jié)果可知，腫瘤進(jìn)程中MDSCs的線粒體質(zhì)量顯著高于正常生理狀態(tài)下MDSCs的線粒體質(zhì)量(圖3)，進(jìn)一步說明腫瘤進(jìn)程中MDSCs的氧化磷酸化水平升高。

表3 髓源性抑制細(xì)胞的乙酰輔酶A含量Table 3 ACA content in MDSCs(U.L-1)

2.5 抑制糖代謝對髓源性抑制細(xì)胞功能的影響

以上結(jié)果表明腫瘤條件下被激活的MDSCs利用氧化磷酸化獲取能量。為了探明腫瘤狀態(tài)下糖代謝改變是否與MDSCs激活和存活能力等直接相關(guān)，我們利用糖代解的特異性抑制劑2-DG，觀察抑制糖代謝途徑對線粒體質(zhì)量、MDSCs豐度及存活能力的影響。

首先，我們通過尾靜脈注射2-DG到小鼠體內(nèi)，3 d后取其骨髓細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分析MDSCs的線粒體質(zhì)量。結(jié)果顯示，2-DG處理后，荷瘤組MDSCs的線粒體質(zhì)量又恢復(fù)至正常水平(圖 3)。

接著，利用流式細(xì)胞儀檢測注射2-DG后MDSCs的豐度，流式數(shù)據(jù)經(jīng)Flow Jo 7.6.1軟件分析(圖4A)。結(jié)果說明，2-DG處理后，荷瘤組MD-SCs的豐度減少，統(tǒng)計結(jié)果見表4。

圖3 MDSCs的線粒體質(zhì)量分析N-MDSC代表正常小鼠MDSCs，T-MDSC代表荷瘤小鼠MDSCs，T-2DG-MDSC代表注射2-DG(0.5 g/kg)的荷瘤小鼠MDSCs。Fig.3 Mitochondrial mass analysis of MDSCsN-MDSC represents MDSCs from normal mice，T-MDSC represents MDSCs from tumor-bearing mice，and T-2DG-MDSC represents MDSCs from tumor-bearing mice injected with 2-DG(0.5 g/kg).

圖4 2-DG處理后MDSCs的存活能力分析(A)MDSCs的豐度流式分析代表圖;(B)MDSCs的凋亡流式分析代表圖。T代表尾靜脈注射PBS的荷瘤小鼠，T-2DG代表尾靜脈注射2-DG(0.5 g/kg)的荷瘤小鼠。Fig.4 The survival ability analysis of MDSCs after 2-DG treatment(A)Representative map of flow cytometry analysis of MDSC abundance;(B)Representative map of flow analysis of MDSC apoptosis.T represents tumor-bearing mice injected with PBS via caudal vein，and T-2DG represents tumor-bearing mice injected with 2-DG(0.5 g/kg)via caudal vein.

最后，利用流式細(xì)胞儀檢測注射2-DG后MDSCs的凋亡水平，流式數(shù)據(jù)經(jīng)Flow Jo 7.6.1軟件分析(圖4B)。結(jié)果顯示，注射2-DG后MDSCs的凋亡率減少，統(tǒng)計結(jié)果見表5。

表4 注射2-DG后髓源性抑制細(xì)胞的豐度Table 4 Abundance of MDSCs after injection of 2-DG

表5 注射2-DG后髓源性抑制細(xì)胞的凋亡率Table 5 Apoptosis ratio in MDSCs after injection of 2-DG

3 討論與總結(jié)

機(jī)體內(nèi)所有的免疫細(xì)胞都由造血干細(xì)胞分化而來[10]。有研究指出，腫瘤發(fā)生過程中，造血干細(xì)胞更偏向分化為髓系細(xì)胞，導(dǎo)致MDSCs在體內(nèi)大量擴(kuò)增[11]。在腫瘤動物模型和癌癥患者中，由腫瘤衍生因子誘導(dǎo)的MDSCs在血液、骨髓、脾臟和腫瘤塊中大量積累，介導(dǎo)T細(xì)胞耐受，從而導(dǎo)致腫瘤逃逸和進(jìn)展、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移[12～15]。在胃癌患者的外周血中，MDSCs的表達(dá)水平高于健康者[16]。這和我們檢測腫瘤條件下MDSCs的豐度及周期的結(jié)果(圖1B，圖2)一致，即在肺癌小鼠模型中，MDSCs在骨髓中被激活。

腫瘤條件下MDSCs被大量激活，這種從靜息到激活狀態(tài)的轉(zhuǎn)變必然伴隨代謝水平的改變。本研究結(jié)果顯示，腫瘤條件下MDSCs的乙酰輔酶A含量和線粒體質(zhì)量增加(表3，圖3)，表明腫瘤進(jìn)程中MDSCs依賴氧化磷酸化代謝。究其原因可能是腫瘤條件下被激活的MDSCs需要更多的能量來維持其功能，而氧化磷酸化作為一種高效的產(chǎn)能方式[17]，正好能提供足夠能量來維持細(xì)胞功能。為了探明腫瘤狀態(tài)下MDSCs糖代謝水平改變是否會影響MDSCs的功能，我們利用2-DG抑制其糖代謝途徑。2-DG是一種葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物，細(xì)胞內(nèi)2-DG經(jīng)己糖激酶磷酸化后阻斷糖酵解，減少ATP產(chǎn)生，激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine phosphate activated protein kinase，AMPK)信號通路[18～19]，因此通常作為葡萄糖代謝抑制劑使用。2-DG不僅能抑制癌細(xì)胞的增殖，還可以影響癌細(xì)胞的遷移[20]。Park等[21]報道，2-DG能抑制癌細(xì)胞的遷移。我們的研究結(jié)果表明，2-DG能抑制MDSCs的激活和凋亡(圖 4，表4，表5)，這提示通過改變糖代謝水平治療腫瘤，不僅能夠針對腫瘤細(xì)胞本身，亦對其微環(huán)境中的免疫細(xì)胞有影響。

綜上所述，腫瘤條件下MDSCs被激活后通過氧化磷酸化代謝，而抑制糖代謝能影響MDSCs的存活能力。但是，關(guān)于2-DG對MDSCs增殖及分化能力的影響還缺乏體外實驗，需要做進(jìn)一步的研究。