宋 濤,陳宗平△,田德美,劉 通,梁國標(biāo),謝智慧,鄒成洪,姚淯洪,黎 旭,許 強

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院:1.泌尿外科;2.高壓氧科，貴州遵義 563000)

腎缺血-再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是臨床常見的病理生理過程，其發(fā)生的常見原因有休克后微循環(huán)再通、腎移植、腎擠壓傷、體外沖擊波碎石、阻斷腎蒂的腎手術(shù)等[1]。RIRI的病理生理學(xué)復(fù)雜，主要表現(xiàn)為近端腎小管細(xì)胞損傷，丟失和炎癥，導(dǎo)致組織損傷和功能障礙[2-3]。因此，如何減輕或避免RIRI已成為臨床醫(yī)生必須高度重視的問題。目前RIRI的發(fā)病機制尚未徹底闡明，可能是多因素共同作用的結(jié)果。其中自由基的生成，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，中性粒細(xì)胞的激活及線粒體損傷、細(xì)胞內(nèi)多種酶的激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等細(xì)胞代謝紊亂相互作用，造成損傷的惡性循環(huán)是其關(guān)鍵所在[4-5]。RIRI是臨床上導(dǎo)致缺血性急性腎衰竭(acute renal failure,ARF)的主要原因之一，病死率很高，即便存活的患者亦會產(chǎn)生不同程度的慢性腎功能損害[6]。缺血再灌注后發(fā)生的腎微循環(huán)障礙和腎血管活性受損是RIRI發(fā)生的關(guān)鍵因素，RIRI可維持腎動脈血流量(RABF)下降并阻礙RIRI的完全恢復(fù)[7-8]。通過RIRI病理生理機制的持續(xù)進展來識別潛在的治療干預(yù)，目前相關(guān)研究證明采取不同治療措施對RIRI治療有一定效果[9-13]，但對RIRI的治療并未得到根本解決。高壓氧是一種對多種疾病治療均有理想效果的方法。對高壓氧作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧可提高血氧濃度，改善各臟器組織氧的供應(yīng)，改善組織代謝，促進細(xì)胞損傷的修復(fù)[14-15]。丹參酮ⅡA是中藥丹參的活性成分之一，具有廣泛的抗RIRI作用[16]。其作用機制同樣表現(xiàn)為：對缺氧缺血所致炎性反應(yīng)的抑制作用、抗纖維化作用、改善能量代謝、清除自由基、減輕鈣超載、抗凋亡作用、影響熱休克蛋白表達、改善血液流變學(xué)及微循環(huán)狀況[17-18]。但是二者聯(lián)合治療RIRI的療效少見報道。層連蛋白(laminin，LN)參與構(gòu)成腎小球及腎小管基底膜，對維持腎臟正常結(jié)構(gòu)有重要作用，當(dāng)RIRI時，腎小球及腎小管基底膜受損時，其表達亦受損；轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是一個多功能細(xì)胞因子，哺乳動物TGF-β共有3種，其中TGF-β1在腎臟水平最高，且最具有生物活性，是由兩條相同的含112個氨基酸的亞單位通過二硫鍵連接成的二聚體，是由多種細(xì)胞分泌的、具有多重生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡及免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，在損傷后組織的修復(fù)與重塑、多種疾病的纖維化中起重要作用。既往研究證明纖維細(xì)胞在包括慢性腎臟病(CKD)在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用，促進組織纖維化[19-21]。本文主要通過對比腎功能的變化、檢測LN、TGF-β1的表達及病死率來評價高壓氧、丹參酮ⅡA聯(lián)合治療大鼠RIRI的治療效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組與模型建造 SD大鼠120只，體質(zhì)量200～300 g，清潔級，雌雄不限(購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心)，分為RIRI組(A組)，高壓氧治療組(B組)，丹參酮ⅡA治療組(C組)，高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療組(D組)，正常組(E組)，假手術(shù)組(F組)，每組均為20只；各組術(shù)前均通過尾靜脈采血1～2 mL，檢測血尿素和肌酐。稱重大鼠后以20%水合氯醛按劑量0.1 mL/100 g采用腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，按無菌操作原則手術(shù)。A、B、C、D組均開腹用無損傷血管夾夾閉雙腎動靜脈1 h后開放血流，E組不做處理;F組僅模擬手術(shù)操作過程，但不夾閉腎動脈，各組術(shù)后均腹腔內(nèi)注射長效青霉素12.5萬單位/只預(yù)防感染，關(guān)閉腹腔。

1.2方法

1.2.1治療方法 D組在開放血流前5 min通過尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(劑量按5 mg/kg，購自上海第一生化制藥有限公司)，開放血流后行高壓氧治療(高壓氧治療操作方法：將實驗動物置于高壓氧艙內(nèi)，純氧洗艙5 min，升壓5 min至0.2 mPa(2ATA),穩(wěn)壓吸氧40 min，減壓10 min。高壓氧處理時持續(xù)通風(fēng)，氧流量維持在1 L/min，艙內(nèi)氧濃度在98%以上)。術(shù)后第1、2、3天再行高壓氧、丹參酮ⅡA聯(lián)合治療共4次。B組單純用高壓氧治療(方法同上)。C組單純用丹參酮ⅡA治療(方法同上)。A、E、F組不用治療，直接觀察。

1.2.2標(biāo)本采集 術(shù)后1、3、5、7、14、30、60、90 d各組分別通過尾靜脈采血1～2 mL后離心取上清液檢測血尿素和肌酐。其間觀察各組的死亡數(shù)并記錄具體死亡時間，解剖大鼠觀察各器官，尤其是腎臟的病理變化情況，分析死亡原因，并在術(shù)后90 d將各組存活大鼠處死，取腎臟標(biāo)本4%多聚甲醛固定，按石蠟切片制作過程(固定、脫水、透明、包埋)制作蠟塊以備HE染色及免疫組化用。

1.2.3腎功能檢測 血液標(biāo)本經(jīng)離心后取上清液于本院檢驗科進行腎功能檢測，采用全自動生化分析儀檢測(OLYM-PUS AU5400)測定血液中尿素氮及肌酐水平。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色 將4%多聚甲醛固定的各組腎組織標(biāo)本石蠟塊進行切片(厚度為5 μm)，常規(guī)脫蠟至水，行HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測 (1)將腎組織石蠟切片(5 μm)常規(guī)脫蠟至水，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，無水乙醇5 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，75%乙醇5 min。(2)磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)沖洗3次，每次5 min。(3)切片至于3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶，重復(fù)步驟(2)。(4)切片置于檸檬酸鹽緩沖液中微波爐中火10 min，中高火5 min進行抗原修復(fù)后冷卻至室溫，重復(fù)步驟(2)。(5)5%山羊血清封閉10 min，甩去多余液體，滴加兔抗LN多克隆抗體(1∶200，武漢博士德生物有限公司)40 μL，同時用PBS代替一抗作陰性對照，置于4 ℃冰箱過夜(約18 h)。(6)將過夜標(biāo)本置于37 ℃恒溫箱復(fù)溫40 min，重復(fù)步驟(2)。(7)滴加抗兔二抗(武漢博士德生物有限公司)40 μL，再次置于37 ℃恒溫箱孵育30 min，重復(fù)步驟(2)。(8) DAB顯微鏡下顯色約10 s，自來水終止并沖洗10 min。(9)HE染色5 min，自來水沖洗10 min，置于1%鹽酸化乙醇分化3 s，自來水沖洗5 min。(10)按如下順序進行脫水透明，75%乙醇5 min，80%乙醇5 min，95%乙醇5 min，無水乙醇5 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅰ10 min。(11)干燥后中性樹膠封片固定；用Leica圖像分析系統(tǒng)進行分析，每張切片隨機采取4個視野，用IPP圖像分析軟件測量每一視野陽性染色區(qū)域的平均吸光度(A)作半定量分析。TGF-β1檢測方法同上。

2 結(jié) 果

2.1不同時間點各組大鼠血肌酐水平比較 各組大鼠肌酐值基線為(36.23±4.74)mmol/L；E、F組肌酐比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在RIRI術(shù)后1 d肌酐迅速升高，其中A組最高[(274.00±126.60)mmol/L]，與B、C、D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在術(shù)后3 d時B、C、D組肌酐迅速下降接近正?；€，術(shù)后5～7 d恢復(fù)正常，A組肌酐在術(shù)后3 d后緩慢下降，術(shù)后5 d后迅速下降,至術(shù)后14 d之后緩慢升高，E、F組保持不變，D組術(shù)后90 d升高最明顯，與各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2不同時間點各組大鼠尿素氮水平比較 各組大鼠血尿素氮基線為(6.51±0.68)μmol/L，在RIRI術(shù)后1 d A、B、C、D組大鼠血尿素氮較E組均明顯升高，其中A組最高[(31.21±12.80)μmol/L]，其他依次為C、B、D組，與E、F組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。E、F組大鼠血尿素氮水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在RIRI術(shù)后3 d時B、C、D組大鼠血尿素氮均明顯下降，而A組大鼠血尿素氮繼續(xù)升高，在術(shù)后3 d達到高峰[(35.60±23.25)μmol/L]，與B、C、D組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組血尿素氮均在術(shù)后14 d基本恢復(fù)正常；除E、F組外，其余各組大鼠血尿素氮在術(shù)后14 d再次緩慢升高或降低，在術(shù)后90 d時D組升高明顯[(10.55±0.24)μmol/L]，與其余各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠不同時間點血肌酐水平比較

續(xù)表1 各組大鼠不同時間點血肌酐水平比較

a：P<0.05，與同時間點A組比較；b：P<0.05，與同時間點D組比較；c：P<0.05，與同組術(shù)前1 h比較；d：P<0.05，與同組術(shù)后1 d比較

A：A組與D組比較；B:B組與D組比較；C：C組與D組比較；D：D組與E組比較；E：D組與F組比較；F：A組與E組比較

圖1 D組大鼠與其余各組大鼠的生存曲線比較

圖2 各組大鼠病理改變(HE，×400)

組別術(shù)前1 hn尿素氮術(shù)后1 dn尿素氮術(shù)后3 dn尿素氮術(shù)后5 dn尿素氮術(shù)后7 dn尿素氮A組206.68±1.442031.21±12.80c1935.60±23.25c1719.38±9.74cd177.36±1.18dB組206.39±0.272023.24±12.64c2010.60±7.56acd209.91±12.13ad206.45±0.98adC組206.63±0.261924.52±11.42c1811.52±5.62acd177.87±2.31acd176.93±1.61dD組206.68±0.591820.15±12.18ac189.01±1.31acd178.02±1.33acde146.25±1.24adE組206.36±0.16206.47±0.21ab206.47±0.37ab206.35±0.68ab206.65±0.61aF組206.42±0.37196.38±0.15ab196.44±0.39ab186.44±0.60ab176.58±0.63a

續(xù)表2 各組不同時間點尿素氮的變化

a:P<0.05，與同時間點A組比較;b:P<0.05，與同時間點D組比較；c:P<0.05，與同組術(shù)前1 h比較；d:P<0.05，與同組術(shù)后1 d比較

2.3各組大鼠死亡情況 本研究中大鼠共死亡37只，其中A組11只，分別死于RIRI術(shù)后2、4、4、12、26、45、45、64、68、72、78 d；B組3只(15.00%)，分別死于RIRI術(shù)后10、25、38 d；C組5只(25.00%)，分別死于RIRI術(shù)后1、3、4、58、75 d；D組12只(60.00%)，分別死于RIRI術(shù)后1、1、4、6、6、6、35、37、45、63、68、75 d；E組2只(10.00%)，分別死于術(shù)后63、74 d；F組4只(20.00%)，分別死于術(shù)后1、4、6、58 d。A組大鼠病死率為55.00%，D組大鼠病死率為60.00%，與E組病死率10.00%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將不同處理策略對大鼠生存率的影響進行Cox回歸模型分析，提示RIRI(RR=7.170,P=0.010,95%CI：1.587～32.389)、高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療(RR=8.735,P=0.005,95%CI：1.951～39.114)均是大鼠死亡的危險因素，即：發(fā)生RIRI導(dǎo)致大鼠死亡風(fēng)險是未發(fā)生RIRI的7.170倍，高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療導(dǎo)致大鼠死亡風(fēng)險是E組的8.735倍。

2.4D組大鼠與其余各組大鼠的生存曲線比較 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并用Log-rank檢驗比較D組與其余各組大鼠生存曲線。D組與A組的中位生存時間分別是63、72 d，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.259，P=0.611)，見圖3A；B、C、E、F組中位生存時間均大于90 d，與D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B～F。

2.5各組大鼠HE染色切片 與E組比較，A組可見腎小管上皮細(xì)胞空泡改變，腎小管可見細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)可見蛋白管型；而B、C組僅少見腎小管細(xì)胞脫落，未見蛋白管型；D組可見腎小管細(xì)胞脫落，腎臟組織纖維化，見圖2。

2.6各組大鼠LN、TGF-β1表達水平比較 LN的表達在各組中依次升高，E、F組表達最強，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，E、F組與其余各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在A組表達最低，其與B、C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組與B、C、E、F組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TGF-β1在E、F組中表達最低，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在D組中表達最強，其與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，C組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。在不同治療組中，可看到LN在各組中隨著各組腎臟損傷的程度不同，LN的表達也各不相同，LN主要表達與腎小管基底膜，E組可見腎臟LN表達連續(xù)，表達較強，而在A組，其表達不連續(xù)且表達較弱，甚至不表達，見圖3。TGF-β1主要表達與腎小球及腎小管，E組表達較少，A組表達較強，D組表達最強，且組織纖維化嚴(yán)重，失去正常腎臟形態(tài)，見圖4。

圖4各組大鼠TGF-β1蛋白表達(圖中黃色區(qū)域為表達部分，×400)

表3 LN、TGF-β1在各組的表達OD值

a:P<0.05，與E組比較；b:P<0.05，與B、C組比較；c:P<0.05，與C組比較；d:P<0.05，與A組比較

3 討 論

RIRI是臨床常見的病理生理過程，是引起急性腎損傷的重要原因之一，主要表現(xiàn)為腎功能下降，腎小球濾過功能受損，血尿素氮和肌酐迅速升高，水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂[22]；其病理表現(xiàn)主要為腎小管細(xì)胞水腫，上皮細(xì)胞脫落及空泡形成[23]。通過實驗建立RIRI模型，發(fā)現(xiàn)血肌酐及血尿素氮在損傷后急劇升高，病理檢查可見腎小管上皮細(xì)胞脫落，腎小管空泡形成，這與既往研究實驗結(jié)果相符。RIRI已越來越受到臨床的關(guān)注，大量實驗已證實多種藥物對RIRI治療有效，但既往實驗多主要研究短期藥物療效，對遠(yuǎn)期腎臟功能恢復(fù)情況及存活情況研究甚少。高壓氧及丹參酮ⅡA是已被證實治療RIRI有效的藥物，二者聯(lián)合治療對RIRI是否有效，長期治療對RIRI后大鼠存活的影響鮮見報道。

本實驗主要通過檢測腎臟濾過功能(血肌酐、尿素氮的變化)，對各組大鼠病死率、生存分析、病理圖片檢查及免疫組織化學(xué)測定LN、TGF-β1的表達評估治療效果。高壓氧的主要生理作用是將溶解在血漿中的氧氣量增加到足以支持組織的水平，而減少需要提取由血紅蛋白攜帶的氧氣。 其具有許多有益的生化效應(yīng)[24]。高壓氧治療可以減輕RIRI后血漿肌酐的增加、腎小球濾過率(GFR)的惡化和組織病理損傷，抑制細(xì)胞凋亡促進腎小管再生從而改善腎臟功能[14-15]，通過實驗本研究發(fā)現(xiàn)高壓氧治療后腎臟濾過功能短期內(nèi)得到明顯改善，繼續(xù)觀察至損傷后90 d，發(fā)現(xiàn)血肌酐及血尿素氮均有較小幅度的緩慢升高，但對大鼠生存率無明顯改變，其病死率較小；病理檢查發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞脫落、空泡較A組少，這與既往研究結(jié)果相符。丹參酮ⅡA具有對缺氧缺血所致炎性反應(yīng)的抑制作用，改善能量代謝、清除自由基、減輕鈣超載、抗凋亡作用、影響熱休克蛋白表達、改善血液流變學(xué)及微循環(huán)狀況[21-24]，實驗可以證明在RIRI后丹參酮ⅡA可以抑制血肌酐、尿素氮的升高，改善腎功能及維持腎臟正常結(jié)構(gòu)；遠(yuǎn)期仍有小幅度的血肌酐尿素氮升高，但大鼠存活率仍高于A組，丹參酮ⅡA治療有效。高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療后腎臟濾過功能在短期內(nèi)明顯改善，但與單純高壓氧及丹參酮ⅡA治療無明顯優(yōu)勢；在損傷后90 d組大鼠血肌酐、尿素氮緩慢上升，與B、C組有明顯差異；通過比較大鼠生存曲線發(fā)現(xiàn)D組大鼠生存率低于B、C組，觀察病理圖片見腎臟組織破壞過重，腎小管萎縮，腎臟纖維化，可以證明高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療較單純高壓氧及丹參酮ⅡA治療遠(yuǎn)期療效較差，且增加病死率。通過免疫組織化學(xué)檢測LN、TGF-β1的表達，發(fā)現(xiàn)在RIRI后LN表達減少而TGF-β1表達增強，既往實驗證實LN主要表達與腎小管及腎小球基底膜，維持腎臟正常結(jié)構(gòu)；TGF-β1可抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解來促進纖維化，最近的研究也證實了TGF-β1能夠?qū)⒗w維細(xì)胞導(dǎo)入各種受傷器官中[21-22]，導(dǎo)致器官纖維化。本實驗與上述研究相符，觀察各組LN的表達，發(fā)現(xiàn)在B、C組LN表達較A組表達增強，而D組表達較少，與A組無明顯差異，可以證明聯(lián)合治療后腎臟組織的損傷未得到糾正與保護。觀察TGF-β1的表達可見D組表達明顯增強，其病理圖片纖維化嚴(yán)重，與既往實驗結(jié)果相符，可以證明聯(lián)合治療后TGF-β1的表達增強促進纖維化形成。通過比較不同治療方法與大鼠生存狀態(tài)的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)RIRI未治療及高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療是大鼠死亡的危險因素，且高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療的危險度強于RIRI未治療。

高壓氧、丹參酮均對RIRI治療有效，二者聯(lián)合治療早期效果較好，但預(yù)后較差。本次實驗均在早期予以治療，后期觀察其療效，各組在腎功能恢復(fù)正常后再次出現(xiàn)緩慢升高，其中D組升高較為明顯，對于D組腎臟濾過功能恢復(fù)正常后出現(xiàn)緩慢升高的趨勢，本研究考慮可能是腎臟健存腎單位負(fù)荷過重，晚期功能受損引起。BRICKER等[25]提出的矯枉失衡學(xué)說(Trade-off Hypothesis)是指機體產(chǎn)生的某種代償機制在發(fā)揮維持某種溶質(zhì)平衡的適應(yīng)性反應(yīng)的同時，對其他系統(tǒng)產(chǎn)生有害作用，導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境紊亂；在腎臟發(fā)生損傷時腎臟通過加強健存腎單位的功能維持機體的平衡，從而加重腎單位的負(fù)荷，導(dǎo)致晚期腎單位因過度濾過，硬化而喪失功能[26]。推測在損傷發(fā)生后，高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療早期促進健存腎單位的濾過，腎功能改善較為明顯，二者聯(lián)合治療使健存腎單位負(fù)荷過重，在遠(yuǎn)期健存腎單位受到損害，從而導(dǎo)致肌酐、尿素氮的逐漸升高，遠(yuǎn)期病死率增加。在健存腎單位受損的過程中通過促進TGF-β1表達增強，抑制小管細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進纖維化，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)期腎臟濾過功能受損并加重其病死率，但相關(guān)機制尚需進一步實驗證明。

本次試驗主要存在的局限性：(1)試驗過程中，僅在大鼠出現(xiàn)傷亡時取腎標(biāo)本及在觀察結(jié)束時即術(shù)后90 d處死存活大鼠取腎標(biāo)本了解腎臟的病理改變，存在一定的局限性，如能在術(shù)后14、30、60 d分別行存活大鼠腎穿刺活檢，了解腎臟的病理改變，也許更加合理；(2)試驗主要采用血肌酐及血尿素氮評估RIRI的指標(biāo)，對于RIRI是否導(dǎo)致其他病變尚不明確，對病死率的分析也存在一定限制。

綜上所述，在RIRI后腎臟濾過功能及形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，腎功能嚴(yán)重受損。單純高壓氧治療能夠增加大鼠RIRI后存活率，高壓氧和丹參酮ⅡA聯(lián)合治療大鼠RIRI與單純高壓氧、單純丹參酮ⅡA治療比較，并無明顯優(yōu)勢，且聯(lián)合治療增加了大鼠的病死率。