孫 野，舒遵華

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)療保險辦公室,長春 130021)

冠心病在中醫(yī)范疇內(nèi)屬于“胸痹心痛”[1]。該病名最早記載于《靈樞·五邪》：“邪在心，則病心痛?！痹凇端貑枴づK氣法時論》：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛，兩臂內(nèi)痛。”“真心痛，手足青至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死?！薄端貑枴た姶陶摗酚址Q為“厥心痛”“卒心痛”[2]。前期階段性研究表明，三苦滴丸對異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血顯著改善，通過抗氧自由基、抑制炎性介質(zhì)浸潤等起作用[3]。本研究通過觀察三苦滴丸對大鼠造模后心肌細(xì)胞死亡、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平的影響，驗(yàn)證三苦滴丸的療效，為研制冠心病心絞痛治療新藥提供科學(xué)依據(jù)，為臨床冠心病心絞痛癥狀緩解提供客觀、有效、不良反應(yīng)小的科學(xué)方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 吉林大學(xué)藥學(xué)院提供Wistar大鼠70只，體質(zhì)量250～270 g，雌雄各半。合格證號：SCXK-(吉)2007-0003。

1.1.2藥物及儀器 復(fù)方丹參滴丸(國藥準(zhǔn)字：Z10950111；天津天士力制藥股份有限公司)，長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供三苦滴丸(試驗(yàn)室批號：20180128；主要成分：三七、苦碟子)，南京建成生物工程研究所提供MDA、SOD，山東利爾康消毒股份有限公司生產(chǎn)碘伏消毒液，天津天泰精細(xì)品化學(xué)品有限公司生產(chǎn)乙醚。德國Bifuge stratos 生產(chǎn)的臺式高速冷凍離心機(jī)。美國伯樂公司生產(chǎn)的BIO0680酶標(biāo)儀，上海第二天枰儀器廠生產(chǎn)的MP120-1型電子天平。

1.2方法

1.2.1分組 將70只雄性Wistar大鼠分為分為空白組(n=10)、模型組(n=10)、假手術(shù)組(n=10)、陽性對照組(復(fù)方丹參滴丸,n=10)、給藥組(三苦滴丸),給藥組再分為高、中、低劑量組,每組10只。給藥組再分為高、中、低劑量組。陽性對照組和給藥組連續(xù)給藥7 d，其他組給予等量蒸餾水，于第8天造模。

1.2.2造模 以1.5%戊巴比妥鈉溶液(0.005 mL)麻醉大鼠后，取仰臥位并于操作臺固定，對大鼠心臟情況采用心電圖記錄，連接呼吸機(jī)，于大鼠胸部行橫行切開，肌肉層鈍性分離，胸骨顯露，距離胸骨0.5 cm左緣處，將胸腔在第4肋間打開，心包剪開，包膜撕開，在距離左冠狀動脈2.5 mm處進(jìn)針，將左心耳和肺動脈圓錐予以帶線縫合，假手術(shù)組不進(jìn)行結(jié)扎，模型組、陽性對照組、給藥組大鼠均結(jié)扎左冠脈的左前降支致缺血，缺血0.5 h后行再灌注2 h。

1.2.3實(shí)驗(yàn)藥物給藥 三苦滴丸按新的制備工藝進(jìn)行制備，0.3克/粒，按照藥物出膏率30%的比例計算，正常人每日用藥12 g/d，按照人與大鼠體表面積核算，低、中、高劑量組分別為120、240、360 mg·kg-1·d-1；陽性對照藥物為復(fù)方丹參滴丸,規(guī)格：每丸27 mg，用時以蒸餾水稀釋成所需濃度。劑量為30 mg·kg-1·d-1。模型組、空白組：給予等體積蒸餾水4 mL，以上各組每天灌胃1次，每只動物均灌胃4 mL，共1周。

1.2.4指標(biāo)檢測

1.2.4.1Western blot 檢測 每組取6只大鼠，依據(jù)試劑說明書提取蛋白，以蛋白定量檢測法(bicinchoninic acid，BCA)繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋濃度曲線，計算蛋白濃度并調(diào)整，后上樣，設(shè)定電泳條件，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，采用封閉液在室溫條件下封閉。加一抗(1∶1 000) 孵育過夜，以磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)沖洗，加二抗，室溫孵育，PBST沖洗后顯色曝光，掃描顯色圖片采用購自上海天能科技有限公司的Gel Image System Ver．4.00軟件行灰度分析，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.2.4.2血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)測定 大鼠再灌注2 h 后處死，取3 mL大鼠心尖血，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，后取上清液測CK-MB水平，嚴(yán)格按說試劑盒明書操作。

1.2.4.3心肌組織SOD、MDA測定 在取心尖血后以生理鹽水洗凈心臟殘血，剪取大鼠缺血區(qū)心肌制成10%組織勻漿液，測SOD、MDA水平，嚴(yán)格按試劑盒明書操作。

1.2.4.4細(xì)胞凋亡檢測 將大鼠心臟組織制作石蠟切片，將組織切片、脫蠟，蛋白酶K中孵育脫水，避光加稀釋液、TUNEL反應(yīng)液，室溫中放置1 h，并在37℃烤箱中放置30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobezidin，DAB)顯色，最后自來水稍洗脫水、透明、封片顯微鏡觀察、拍照，找到凋亡細(xì)胞區(qū)，后隨機(jī)取每張切片5個高倍視野，計算視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取平均值為凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1血清MDA、SOD、CK-MB的檢測 與空白組比較，模型組、陽性對照組、假手術(shù)組及高、中、低劑量組的MDA、CK-MB水平均顯著增高。除假手術(shù)組外，其余組SOD水平均顯著減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組的MDA、CK-MB水平顯著低于中、低劑量組，SOD水平顯著高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2Cleaved-Caspase3、Bcl-2、細(xì)胞凋亡數(shù)、核因子(NF)-κB蛋白的檢測 與模型組比較，陽性對照組，假手術(shù)組，高、中、低劑量組的Bcl-2水平均顯著升高，而Cleaved-Caspase3、細(xì)胞凋亡數(shù)、NF-κB水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組的Cleaved-Caspase3、細(xì)胞凋亡數(shù)、NF-κB水平顯著低于中、低劑量組，Bcl-2水平顯著高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表1 各組心肌缺血大鼠血清MDA、SOD、CK-MB水平

a：P<0.05，與空白組比較

表2 各組心肌缺血大鼠Cleaved-Caspase3、Bcl-2、細(xì)胞凋亡數(shù)水平‰)

a：P<0.05，與空白組比較

A：空白組；B：模型組；C：陽性對照組；D：低劑量組；E：中劑量組；F：高劑量組

圖1三苦滴丸對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL染色×40)

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)是心肌組織在長時間缺血后恢復(fù)血液灌流，反而出現(xiàn)比再灌注前更嚴(yán)重的損傷和功能障礙[3-4]。迄今為止，經(jīng)研究在心肌缺血方面取得了一定的進(jìn)展，其機(jī)制研究存在多種假說，主要包括氧自由基的生成、鈣超載、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡、壞死和自噬，血小板聚集和微血栓，免疫激活和炎性反應(yīng)等[5-6]。近年來，在心肌缺血再灌注損傷的方面進(jìn)行了深入的研究[7-8]。

本研究探析三苦滴丸對大鼠心肌缺血再灌注損傷和心肌細(xì)胞凋亡的緩解技術(shù)研究，結(jié)果與孫鳳娟等[9]的研究結(jié)果大體一致。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對苦碟子進(jìn)行了大量研究工作，發(fā)現(xiàn)苦碟子的化學(xué)成分十分復(fù)雜[10-11]。心臟內(nèi)存在大量的酶類物質(zhì)完成心臟的正常生理功能，因心肌缺氧缺血損傷及細(xì)胞膜的通透性增高，促使心肌內(nèi)含有的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、CK-MB、肌酸激酶等大量釋放入血，促使血清中濃度增高。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組的MDA、CK-MB水平顯著低于中、低劑量組，SOD水平顯著高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明三苦滴丸可改善心肌缺血模型大鼠心肌酶CK、CK-MB有改善作用，減輕心肌損傷，其中三苦滴丸高劑量組效果更佳。心肌缺血的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以調(diào)控心肌細(xì)胞的損傷，心肌缺血時存在復(fù)雜而廣泛的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)交匯，并對缺血心肌發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用。NF-κB是Rel蛋白家族成員，可與免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈基因增強(qiáng)子序列特異結(jié)合。NF-κB是由p65級多肽p50亞基形成的二聚體，包括異源性或同源性二聚體，最常見及最多發(fā)揮生理功能的是p50～p65異源二聚體。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組的Cleaved-Caspase3、細(xì)胞凋亡數(shù)、 NF-κB水平顯著低于中、低劑量組，高劑量組的Bcl-2水平顯著高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示三苦滴丸可升高心肌組織內(nèi)的NF-κB蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而對NF-κB水平產(chǎn)生抑制作用，減輕心肌缺血。臨床試驗(yàn)和藥理學(xué)研究表明，苦碟子有心血管、抗腫瘤和降血脂等多方面的生物活性[12-13]。經(jīng)化學(xué)分析，其主要成分為黃酮類及腺苷類物質(zhì)。在心血管疾病方面，苦碟子對擴(kuò)張冠狀血管有顯著療效，可改善心肌微循環(huán)和增加冠脈血流量；研究證明苦碟子在心、腦血管方面具有顯著的療效[14-15]?？嗟蝇F(xiàn)常用于治療冠心病、缺血性腦血管疾病，有效率達(dá)93.3%。較治療前差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，血瘀癥患者血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)及血管內(nèi)皮素的水平增高，證明了苦碟子確切的活血化瘀功效[16-18]。表明三苦滴丸能通過作用Caspase蛋白、調(diào)控Bcl-2 基因表達(dá)來減少細(xì)胞凋亡，抑制I/R損傷后氧化應(yīng)激，減輕全身炎性反應(yīng)，提高心肌對抗I/R的能力，有效保護(hù)心肌細(xì)胞。

綜上所述，三苦滴丸可以減輕缺血再灌注后大鼠氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，有效減輕心肌損失。