武鑫玲，姜 娟

(1.鄭州人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，鄭州 450053；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，北京 100044)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心內(nèi)科常見疾病之一，預(yù)后較差，具有較高的病死率，給人們的健康帶來嚴重威脅。AMI是由于心臟的供血血管發(fā)生急性閉塞，影響相應(yīng)的心肌組織的血供而導(dǎo)致短時間內(nèi)出現(xiàn)缺血、缺氧，甚至發(fā)生壞死[1]。傳統(tǒng)觀點認為，AMI時心肌組織的損傷為不可逆。而最近研究表明，哺乳動物的心肌細胞在AMI時仍未退出細胞周期，因此仍具有再生能力[2-3]?；颊叩男呐K功能在AMI發(fā)生早期受到調(diào)節(jié)會發(fā)生心肌重構(gòu)。他汀類藥物是目前臨床降脂、降壓的常用藥物。研究顯示，他汀類藥物有助于改善心肌重構(gòu)。瑞舒伐他汀是一種他汀類藥物，具有穩(wěn)定冠狀動脈粥樣硬化斑塊、抗炎、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖，保護心肌細胞的作用[4-5]。本研究通過AMI大白兔模型的建立，觀察他汀類藥物對兔AMI后心肌重構(gòu)的作用，并探索其中的作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑 HPSonos 5500超聲診斷系統(tǒng)(美國HP公司)，美國ABI9700RT-PCR擴增儀(美國Thermo公司)；瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥有限公司，批準文號H20110563)，基質(zhì)金屬蛋白(MMP)-2、-9、-10，骨膜蛋白(Perionstin蛋白)及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1兔多克隆抗體(美國BD公司)。

1.1.2實驗動物 大白兔，雄性，18個月齡，體質(zhì)量(2.41±0.11)kg，合格證號[SCXK(蘇)2007-0008]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫，濕度45%～70%，自由進食飲水。

1.2方法

1.2.1造模與給藥方法 首先麻醉兔，于腹腔注射20%烏拉坦(0.4 mL/kg)，固定兔子仰臥于手術(shù)臺上，將頸部及胸部被毛剪除，將頸部皮膚縱形剪開1.5～2.0 cm，對于皮下組織及肌肉進行分離，使氣管及其上甲狀腺腺體顯露；鈍性分離氣管并帶線，將絲線提起，于氣管環(huán)之間將氣管剪開半周，行氣管插管；對呼吸參數(shù)，包括呼吸頻率、吸呼比及潮氣量進行調(diào)整；胸骨左緣3 mm將胸部皮膚縱形剪開約4 cm，對皮下、胸大肌與前鋸肌進行鈍性分離，對胸大肌及前鋸肌進行縫合、牽開，使肋骨及肋間肌顯露，將肋間肌于第3肋間逐步剪開，使胸膜顯露，于呼氣時刺破胸膜進入胸腔；撐開肋骨，顯露心臟；探查確定左心耳，結(jié)扎冠狀動脈左前降支近端，13 mm針Prolene線縫扎，出針，打結(jié)，探查無出血后關(guān)胸，將一根吸引管留置于胸腔內(nèi)，縫合肋間對術(shù)野進行消毒；對合胸大肌與前鋸肌并縫合，將胸腔積氣積液用針筒抽吸，將吸引管拔出；兔子蘇醒后，拔管，對氣道血塊及分泌物進行清理，氣管切口以Prolene線一針縫合，碘伏消毒術(shù)野，對合肌肉及皮下，縫合頸部切口。手術(shù)后24 h內(nèi)11只大白兔死亡。將存活的69只兔子分為3組：心肌梗死對照組(MI組，n=20)、瑞伐他汀組(R組，n=22)、假手術(shù)組(S組，n=27)。S組并不在冠狀動脈處結(jié)扎僅穿線；R組兔子灌胃給予10 mg·kg-1·d-1瑞舒伐他汀鈣，每日1次，灌胃處理4周；MI組建立AMI后不予任何操作。

1.2.2超聲心動圖檢查 干預(yù)結(jié)束使用HP Sonos 5500超聲診斷系統(tǒng)(頻率12 MHz)對3組大白兔進行超聲心動圖檢查。檢測指標包括左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心房直徑(LAD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室短軸縮短率(LVFS)等。

1.2.3左心室梗死面積計算 將左心室切片置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中染色30 min，蒸餾水沖洗后，心肌梗死區(qū)未著色顯示灰白色，非梗死區(qū)經(jīng)過染色后顯示深紅色。采用ImagePro Plus軟件(version 6.0)計算梗死面積和左心室總面積，以梗死面積/左心室總面積表示梗死面積的大小。

1.2.4檢測細胞凋亡率 常規(guī)TUNEL法，由福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供試劑盒，檢測心肌組織中的凋亡細胞。光鏡觀察細胞核棕色為陽性，凋亡指數(shù) (AI) =視野凋亡數(shù)/視野內(nèi)細胞總數(shù)×100%。

1.2.5檢測心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3的表達 將心肌組織用機械法剪碎，過濾并制成單細胞懸液，將5 mL單細胞懸液加入試管中，常規(guī)離心后去上清液，加入100 μL固定液后混勻，靜置15 min。加4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，常規(guī)離心，去上清液，加入100 μL裂解液，室溫靜置入5 min。加5 μL美國Santa Cruz Biotechnology的Caspase-3抗體，混勻，避光靜置15 min。加4 mL PBS，離心，去上清液，加PBS 0.5～1.0 mL。使用日本BD FACSCantoTMⅡ流式細胞儀檢測。

表1 3組大白兔超聲心動圖指標比較

a：P<0.05，與S組相比；b：P<0.05，與MI組相比

1.2.6檢測p-p38蛋白和p38 常規(guī)方法提取樣品蛋白，標化后聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后，以5%的脫脂牛奶1∶200稀釋兔單抗p-p38抗體(美國Santa Cruz Biotechnologyy)、兔單抗p38抗體(美國Santa Cruz Biotechnology)，1∶1 000稀釋兔多抗actin抗體(武漢博士德公司)；置搖床4 ℃孵育過夜;將辣根過氧化物酶(HPR)標記的鼠、兔二抗用5%脫脂牛奶1∶200稀釋，常溫搖床上孵育聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，之后于凝膠成像系統(tǒng)曝光。

2 結(jié) 果

2.13組大白兔超聲心動圖指標比較 3組間超聲心動圖指標比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與S組相比，MI組與R組的LAD、LVDd和LVDs均顯著增加，同時LVEF和LVFS降低(P<0.05)；R組LAD、LVDd和LVDs與MI組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI組(P<0.05)，見表1。

2.23組大白兔心肌梗死面積比較 S組心肌梗死面積為0，MI組(37.92±4.29)%與R組(36.71±3.98)%間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3瑞伐他汀對兔子心肌梗死邊緣區(qū)細胞凋亡的影響 MI組[(24.42±2.52)%]和R組[(9.31±0.31)%]凋亡指數(shù) (AI)顯著高于S組[(2.65±0.32)%](P<0.05)，R組AI較MI組顯著降低(P<0.05)。

2.4不同組心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3的表達情況 R組及MI組心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3表達較S組明顯升高，而R組較MI組顯著降低(P<0.05)，見圖1。

2.5不同組心肌梗死邊緣區(qū)相關(guān)蛋白表達情況 MI組、R組、S組p38表達均未見明顯差異，MI組和R組p-p38表達較S組顯著升高，而R組較MI組顯著降低(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，MI組與S組比較；b：P<0.05，R組與MI組比較；c：P<0.05，R組與S組比較

圖1各組心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3的表達

A：Western blot法檢測兔心肌梗死邊緣區(qū)p38、p-p38的表達；B：半定量分析；a：P<0.05，S組與MI組比較；b：P<0.05，R組與MI組比較；c：P<0.05， R組與S組比較

圖2各組兔心肌梗死邊緣區(qū)p38、p-p38的表達

3 討 論

AMI后心肌細胞受損，導(dǎo)致心室肥厚、擴張，心肌收縮力下降，心肌纖維化增加，最終導(dǎo)致心力衰竭，給患者帶來嚴重后果[6-7]。本研究中建立AMI大白兔模型，以探究AMI的發(fā)病機制，以及可能存在的病理變化。

本研究在對兔子模型進行不同干預(yù)4周后行超聲心動圖檢測，結(jié)果顯示，與S組相比，MI組與R組的LAD、LVDd和LVDs均顯著增加，同時LVEF和LVFS降低(P<0.05)，說明大白兔在心肌梗死后出現(xiàn)心臟擴大、左心室收縮功能不全。另外，R組LAD、LVDd和LVDs與MI組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI組(P<0.05)，提示瑞舒伐他汀能増強心肌梗死大白兔的左心功能。但MI組與R組間的心肌梗死面積比較并未見顯著差異(P>0.05)，提示瑞舒伐他汀并不能達到顯著地減少心肌梗死面積的目的。

心室重構(gòu)是心肌細胞凋亡所引起，有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠除梗死區(qū)外，梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)亦可檢出細胞死亡，而這是引起左心室重塑和晚期心功能不全的重要因素[8-9]。本研究結(jié)果顯示，R組心肌細胞AI較MI組顯著降低(P<0.05)，提示瑞伐他汀治療能減少心肌細胞凋亡，可能通過抑制心肌凋亡，而使心功能改善。

目前認為他汀類藥物可能通過抑制心肌凋亡而使心功能改善，分析其抑制心肌細胞凋亡可能的作用機制[10-12]：(1)通過抗氧化作用抑制心肌凋亡；(2)通過調(diào)控絲氨酸-蘇氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶，下調(diào)Caspase-3 活性。Caspase-3在細胞的凋亡中起關(guān)鍵作用，是凋亡途徑中的執(zhí)行者。p38屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中的一個主要成員，研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死后，p38并未增高，但p-p38在心肌梗死后7 d時升高2倍以上，p-p38能激活凋亡程序中最后的執(zhí)行者Caspase-3的活性，使凋亡通路啟動，活化的Caspase-3又能導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細胞發(fā)生凋亡[13-15]。本研究中，R組p-p38、Caspase-3的表達低于MI組，推測瑞舒伐他汀可能通過抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，從而抑制心肌細胞凋亡，改善心功能。結(jié)果表明瑞舒伐他汀能抑制心肌凋亡、改善心功能，但無法逆轉(zhuǎn)已梗死的心肌組織，提示已壞死的心肌組織無法通過藥物恢復(fù)正常功能。因此，早期對AMI患者使用保護心肌細胞藥，避免梗死進一步加重是改善患者預(yù)后、提高生存率的重點。

綜上所述，瑞舒伐他汀可以使AMI大白兔的心臟功能顯著改善，可能通過抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，抑制心肌細胞凋亡，改善心室重構(gòu)。