師亦潔 ，周峰旭，李 鮮，范宇超，劉宏程

1昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500；2農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明) 云南省農(nóng)業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所， 昆明 650223

石斛屬(Sect.Dendrobium)隸屬于蘭科(Orchidaceae)，約有1 000種，在我國發(fā)現(xiàn)有74種和2變種，產(chǎn)秦嶺以南諸省區(qū)，尤其云南南部為多[1]。石斛作為我國傳統(tǒng)中藥[2]，具有抗腫瘤[3]、增強免疫[4]、抗氧化[5]、緩解糖尿病[6]等多種藥理學作用。主要是石斛多糖[7、8]，酚類化合物[9]，芳香族化合物和倍半萜類化合物[10]等功能成分。

對石斛中功能成分測定方法有很多，如周曉梅等[11]對4種不同石斛中香豆素的含量進行測定。劉妍妍等[12]對云南產(chǎn)的37個品種的石斛中的濱蒿內酯含量進行測定。也有研究表明，曾從鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[13]與疊鞘石斛(Dendrobiumaurantiacumvar.denneanum)[14]中分離得到紫丁香苷。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，石斛中含有阿魏酸[15]和松伯醇[16]，松柏醇與葡萄糖成苷后即為松柏苷。但對于石斛中松柏苷與紫丁香苷等苯丙醇類化合物的含量測定則未見報道。

本實驗首次建立了一種在不同波長下同時測定石斛屬中松柏苷和紫丁香苷兩種苯丙醇類化合物以及東莨菪內酯、濱蒿內酯和香豆素三種香豆素類化學物的含量分析方法。該方法以期為石斛品種的區(qū)分、質量控制以及不同石斛品種間藥理活性的差異研究提供一種新的分析方法。

1 儀器與材料

Waters Alliance e2695型高效液相色譜(四元梯度洗脫系統(tǒng)、2489紫外檢測器、Empower 3色譜工作站,美國Waters公司)；BT 25 S型分析天平(德國Sartorius公司)；KQ500-E型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

松柏苷對照品及紫丁香苷對照品(北京世紀奧科生物技術有限公司，HPLC≥98%)，東莨菪內酯對照品(中國食品藥品檢定研究所，HPLC≥98%)，濱蒿內酯對照品(北京索萊寶科技有限公司，HPLC≥98%)，香豆素對照品(北京百靈威科技有限公司，HPLC≥99%)；乙腈、甲醇(色譜純,德國Merck公司)； 實驗室用水為去離子水。

五種目標成分的化學結構如下圖所示：

球花石斛、鼓槌石斛、齒瓣石斛、鐵皮石斛、流蘇石斛、金釵石斛、疊鞘石斛、束花石斛樣品均由云南熱帶作物研究院(國家石斛種資資源圃)李守領老師鑒定和提供。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件的選擇

圖1 五種成分的化學結構Fig.1 Chemical structure of five components注：1.松柏苷；2.紫丁香苷；3.東莨菪內酯；4.濱蒿內酯；5.香豆素。Note:1.Cypressin；2.Syringin；3.Scutellarin；4.Scoparone；5.Coumarin.

2.1.1 雙波長的選擇

通過全波長掃描(210 ～ 440 nm)，可知各目標化合物最大吸收波長，見表1。通過對比各波長下目標化合物響應，在260 nm處苯丙醇類物質有較大吸收，但此波長下的香豆素類物質響應較低，而在325 nm處，香豆素類物質有較大吸收。且在這兩個波長下，雜質影響較小，故最終選定分析波長為260 nm和315 nm。對照同等條件下單一對照品保留時間可知，如圖2，在兩個波長下，各目標化合物均有較好響應。

表1 化合物最大吸收波長

圖2 混合對照品HPLC圖譜Fig.2 HPLC comparison of mixed controls注：1.圖2a為260nm，圖2b為315nm；2.從左至右，峰依次為：A.松柏苷、B.紫丁香苷、C.東莨菪內酯、D.濱蒿內酯、E.香豆素。Note:1.Fig 2a is 260nm,Fig 2b is 315nm;2.From left to right,the peaks are A.cedarin,B.syringin,C.scutellarin,D.scoparone,E.coumarin.

2.1.2 流動相和流速的選擇

在前期試驗中，對比了甲醇-水以及乙腈-水體系，發(fā)現(xiàn)在乙腈-水體系下各峰峰形較好。對比了1.0、0.8、0.5 mL/min等幾個流速，發(fā)現(xiàn)在0.8 mL/min流速下，各峰能夠有較好的分離度，且分析時間適中。

2.1.3 色譜條件

Shiseido CAPCELL PAK MG Ⅱ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A):水(B)，梯度洗脫程序如下：5% A→20% A(0～20 min),20% A→30% A(20～30 min),30% A(30～40 min),30% A→5% A(40～45 min)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：260 nm，315 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。混合對照品色譜圖見圖2。

2.2 混合對照品溶液制備

精密稱取各對照品5.00 mg分別置于10 mL容量瓶中，分別加入10 mL 5%乙腈定容，即得濃度為0.5 mg/mL的單一對照品儲備溶液。精密量取各單一對照品溶液各20 μL混合，即得濃度為0.1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液

2.3.1 提取條件的優(yōu)化

因香豆素類物質不溶于冷水，易溶于熱水、醇、乙醚、氯仿等，苯丙醇類物質溶于熱水和乙醇，微溶于冷水，而石斛中普遍含有豐富的多糖，且多糖易溶于熱水。故實驗對比了純甲醇、80%甲醇和純水，在相同條件和時間下的提取效果，結果顯示純甲醇提取條件下各成分均能提取得較完全。實驗還對比了單純純甲醇提取以及用水提取一次后，棄去水提部分再以純甲醇提取，結果顯示，單純先以水提取一次并不能較好除去相關干擾雜質，且會造成一部分目標化合物的損失，故選擇以單純純甲醇提取。測定結果如表3所示。

表3 提取條件選擇結果(μg/g)

提取時間：對比了超聲提取20、30、40 min，結果表明30 min即可達到較好的提取效果。比較了提取1、2、3次的提取效率，結果表明，重復提取兩次即可對目標成分提取得較為完全。

2.3.2 樣品溶液制備

分別精密稱取八個品種石斛干燥粉末1.0 g置于錐形瓶中，分別加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，重復提取兩次，合并提取液，于旋轉蒸發(fā)儀上減壓水浴蒸干后，用2 mL甲醇溶解，過0.45 μm水系微孔濾膜后置于進樣瓶中備用。

2.4 檢出限和線性范圍考察

按照3倍信噪比(S/N=3)來確定儀器檢出限。將混合對照品溶液分別以初始比例流動相稀釋1、2、5、10、20、50、100倍，分別進樣，按“2.1”項色譜條件下進行分析，以混合對照品含量X(μg/mL)為橫坐標，色譜峰面積As為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算。五種目標成分的回歸方程見表2。由結果可知，在測定濃度范圍內，各目標成分均有較好的線性。

2.5 精密度實驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件重復進樣6次，五個目標成分峰面積的RSD分別為0.71%、1.03%、0.61%、0.66%、0.62%。結果表明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗

取同一批樣品(鼓槌石斛)6份，按“2.3”項下條件操作，按“2.1”項色譜條件分析，五個成分峰面積RSD分別為0.47%、0.89%、0.34%、0.18%、0.71%。結果表明該方法重復性良好。

表3 五種目標成分回歸方程

2.7 穩(wěn)定性實驗

取樣品溶液(鼓槌石斛)，于室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、24 h，按“2.1”項下色譜條件分析，五個成分峰面積RSD分別為0.42%、1.01%、0.74%、1.20%、1.21%。結果表明樣品在24 h內穩(wěn)定。

2.8 加樣回收實驗

稱取已知含量的樣品(鼓槌石斛)9份，每份1.0 g，按低、中、高濃度(每個濃度三份，9份)加入對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，結果見表3。在30～540 μg加標濃度范圍內，平均回收率在99.80%～100.90%，RSD為0.62%～1.58%。

2.9 樣品含量測定

取“2.3”項下八個不同品種石斛樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，結果見表4。

3 結論

由含量測定結果(表4)可以看出，不同品種的石斛，其所含苯丙醇類和香豆素類化合物的種類及其含量均有較大差異：七種石斛中均含有紫丁香苷，僅在球花石斛中未檢測到紫丁香苷；七種石斛中均含有濱蒿內酯，僅疊鞘石斛中未檢測到其存在；齒瓣石斛中五種目標物質的含量較其他幾個品種的石斛均較低；而在鼓槌石斛中五種目標物質含量均高于其他幾個品種。從結果可看出，相同產(chǎn)地的不同品種石斛中的有效成分種類及含量均存在較大差異，故可通過對其不同有效成分間含量的測定，對石斛的品種進行初步的區(qū)分。

表4 加樣回收率(n=3)

表5 八個品種石斛含量測定結果(μg/g)

對香豆素類化合物含量測定結果與已有文獻對比：周曉梅等[11]研究結果表明其測定的4個石斛品種中僅疊鞘石斛中含有香豆素。劉妍妍等[12]研究結果顯示云南產(chǎn)37個石斛品種中僅密花石斛和球花石斛中含有濱蒿內酯，但研究者也表示由于樣品總數(shù)較大 ，每份樣品量較少 ，在檢測過程中部分樣品只顯示痕量，未能計算出具體含量 ，故記為“未檢出”，但不能排除其他種石斛含有微量濱蒿內酯的可能性?？梢钥闯?，這些結果與本實驗得到結果存在一定差異，分析原因可能是由于石斛樣品的產(chǎn)地或采收期的不同造成了這種含量差異，后期還可對相同品種不同產(chǎn)地或不同采收期的石斛中香豆素類含量進行測定、比較，以期對市售常見石斛品種的質量控制提供參考。

松柏苷為松伯醇的苷類化合物。松柏苷的含量研究僅在筒鞘蛇菰(Balanophorainvolucrata)中可見，紫丁香苷含量研究主要集中于刺五加(Acanthopanaxsenticosus)等，也有報道從鐵皮石斛[13]與疊鞘石斛[14]中分離得到紫丁香苷。在實驗過程中，我們已選用不同流動相體系(甲醇/水，甲醇/甲酸)以及不同流動相比例分離樣品中紫丁香苷與松伯苷，其與混合對照品中保留時間一致(保留時間偏差小于5%)，未發(fā)現(xiàn)有其他干擾物質。同時采用DAD對樣品中紫丁香苷和松伯苷進行全波長掃描，其吸收波長與對照品的吸收波長一致，可確定樣品中含有紫丁香苷和松伯苷。本實驗首次對石斛中兩種苯丙醇類化合物進行了含量測定，結果顯示大多數(shù)石斛品種中均含有這兩種物質。

文獻報道，紫丁香苷具有降血脂[17]、增強免疫[18]、對心肌缺血保護[19]、抗氧化[20]、抗抑郁[21]等功效。而針對松柏苷的生物活性研究仍較少，僅有部分文獻報道其有抗氧化[22]作用。對比石斛屬已研究發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤[3]、增強免疫[4]、抗氧化[5]、緩解糖尿病[6]等生物活性。因此所建立的分析方法對石斛屬新的生物活性研究奠定基礎。