姜鴻瑞，韓紫音，夏海磊，王夢(mèng)琦，冀德君，毛永江，楊章平，張慧敏

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens）屬于革蘭氏陰性菌，亦稱靈桿菌[1]，是一類腸道桿菌，普遍存在于水和土壤中，可在低溫下生長(zhǎng)繁殖，低溫食品極易受其污染，如乳制品、水產(chǎn)品、禽類產(chǎn)品等。此外，S. marcescens是一種條件性致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)就會(huì)引起肺炎、敗血癥、腦膜炎等各種疾病，并且對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。近年來(lái)，S. marcescens引發(fā)感染的事件越來(lái)越多，逐漸引起人們的重視。

S. marcescens可分泌多種胞外水解酶，如耐熱脂肪酶及蛋白酶，這些酶可水解牛奶中的蛋白質(zhì)和脂類，進(jìn)而導(dǎo)致牛奶變質(zhì)，產(chǎn)生苦味、異味、不潔味等。牛奶的熱處理工藝雖然可以殺滅微生物，但對(duì)耐熱酶沒(méi)有作用，耐熱酶的活性基本不受影響，給乳制品安全帶來(lái)巨大的隱患[2,3]。研究發(fā)現(xiàn)，S. marcescens是原料乳低溫貯藏期間的主要嗜冷菌之一，由此可見(jiàn)，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)原料乳中S. marcescens對(duì)保障原料乳質(zhì)量安全有重要意義。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于原料乳中致病菌的檢測(cè)，如金黃色葡萄球菌、沙門菌屬等[4]。為了準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)原料乳中的S. marcescens，本研究選取對(duì)S. marcescens有特異性的S-核糖基高半胱氨酸酶（luxS）基因作為檢測(cè)的靶基因[5]，建立原料乳中S.marcescens的高靈敏、高特異的實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)體系，為原料乳的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘質(zhì)沙雷氏菌ATCC14756、熒光假單胞菌ATCC13525、魯氏不動(dòng)桿菌ATCC15309、阪崎腸桿菌ATCC29544購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室提供；沙門氏菌ATCC13076、李斯特菌ATCC15313由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理與毒理實(shí)驗(yàn)室提供；pUCm-T和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海Sangon公司；Taq酶、DNA純化試劑盒、SYBR? Premix Ex Taq? II (TliRNaseH Plus)和DNA Marker均購(gòu)自大連TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302購(gòu)于天根生化科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。梯度PCR儀及ND-1000微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)為美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；熒光定量PCR擴(kuò)增儀7500為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像分體系統(tǒng)為SYNGENE公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的對(duì)S. marcescens有特異性的luxS基因（GenBank登錄號(hào)：EF164926.1，AJ628150.1）設(shè)計(jì)特異性引物[5]。引物由上海生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.2 luxS基因克隆

S. marcescens在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，取1mL離心收集菌體，參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA。以S. marcescens的DNA為模板，SM-F、SM-R為引物進(jìn)行PCR，然后將PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收后連入pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)平板篩選和酶切鑒定正確后，送上海生物工程公司測(cè)序。

1.2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將S. marcescens在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，用平板菌落記數(shù)法定量，采用LB培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到不同濃度菌液。提取梯度濃度菌液的基因組DNA，然后采用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10μL；SM-F 0.8μL，SM-R 0.8μL；DNA模板 2.0μL；ddH2O 6.0μL；Rox Reference Dye Ⅱ 50×0.4μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30s；95℃ 5s，61℃ 34s，40個(gè)循環(huán)；在61℃退火階段收集熒光值，并在上述擴(kuò)增條件后增加60～95℃的融解曲線分析。每個(gè)樣本3個(gè)平行，進(jìn)行熒光定量PCR后得到相應(yīng)的Ct值，以菌落數(shù)的lg值和Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 特異性試驗(yàn)

提取6種乳中常見(jiàn)微生物（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、阪崎腸桿菌、熒光假單胞菌）的基因組DNA，并分別以其為模板，采用1.2.3中的熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以S. marcescens作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)該方法的特異性。

1.2.5 靈敏度評(píng)價(jià)

以1.2.3中獲得的梯度濃度S. marcescens基因組DNA為模板，SM-F和SM-R為引物進(jìn)行常規(guī)PCR，其反應(yīng)條件為：95℃ 3min，30個(gè)循環(huán)（95℃ 30s，61℃30s，72℃ 30s），72℃ 10min。評(píng)價(jià)熒光定量PCR與普通PCR檢測(cè)方法的靈敏度。

1.2.6 人工陽(yáng)性樣品乳檢測(cè)

將1.2.3中已經(jīng)定量的菌液，采用滅菌全脂乳進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到不同濃度菌液。離心去脂肪，沉淀用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次，然后采用文獻(xiàn)中報(bào)道的方法提取人工陽(yáng)性樣品乳中的DNA[6]，并按照1.2.3中的方法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.2.7 熒光定量PCR檢測(cè)原料乳中的S. marcescens

在不同的月份(2015年的11月、12月份及2016年的1月份)，從江蘇省揚(yáng)州市周邊8個(gè)奶牛場(chǎng)中采集原料乳樣品，提取奶樣DNA，進(jìn)行熒光定量PCR及常規(guī)PCR檢測(cè)，確定每個(gè)牧場(chǎng)的原料乳是否污染了S.marcescens，以此監(jiān)控每個(gè)牧場(chǎng)的奶源質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳

首先以S. marcescens的DNA為模板，利用引物SM-F和SM-R進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1(泳道1)所示。圖1顯示，在180bp處有一特異性條帶。將目標(biāo)條帶進(jìn)行割膠回收后連入質(zhì)粒pUCm-T進(jìn)行測(cè)試，測(cè)序結(jié)果顯示luxS部分基因片段長(zhǎng)度為175bp，與擬克隆的基因序列只有1個(gè)堿基不同，與理論片段同源率為99.43%。

圖1 luxS基因 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將S. marcescens過(guò)夜培養(yǎng)，采用菌落平板記數(shù)法定量菌液濃度為6.9×109cfu/mL，經(jīng)稀釋后，得到不同濃度菌液（6.9×101、6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107cfu/mL）。以細(xì)菌數(shù)的lg值和Ct值制作熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=-1.864x+31.32，相關(guān)系數(shù)為0.999），結(jié)果表明不同梯度濃度細(xì)菌數(shù)的lg值與Ct值之間具有良好的線性關(guān)系[7～9]，熒光定量PCR的Ct值與初始模板在6個(gè)lg濃度范圍內(nèi)（菌落數(shù)為6.9×107～6.9×102cfu/mL）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。當(dāng)菌落數(shù)達(dá)到6.9×101cfu/mL進(jìn)行擴(kuò)增后，其Ct值大于水的Ct值（圖2），故該濃度下不能對(duì)luxS基因進(jìn)行有效的檢測(cè)。由此可知，該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限可達(dá)到6.9×102cfu/mL。

圖2 熒光定量PCR擴(kuò)增

2.3 熒光定量PCR試驗(yàn)的敏感性

通過(guò)試驗(yàn)可以確定熒光定量PCR檢測(cè)的最低菌落數(shù)（6.9×102cfu/mL），然后以試驗(yàn)中獲得的不同濃度菌液的基因組DNA為模板，SM-F和SM-R為引物進(jìn)行常規(guī)PCR，比較熒光定量PCR與常規(guī)PCR的敏感性[10]，如圖3所示，常規(guī)PCR檢測(cè)S. marcescens的靈敏度是6.9×103cfu/mL，由此可見(jiàn)熒光定量PCR的靈敏度較高。

圖3 常規(guī)PCR檢測(cè)luxS的靈敏度

2.4 熒光定量PCR試驗(yàn)的特異性

如圖4所示，熒光定量P C R結(jié)果顯示只有S.marcescens樣品出現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而其余6種乳中常見(jiàn)微生物均未出現(xiàn)相應(yīng)的熒光擴(kuò)增曲線。經(jīng)過(guò)溶解曲線分析，特異性溶解曲線呈現(xiàn)單一峰形。說(shuō)明該方法檢測(cè)S. marcescens具有良好的特異性。

圖4 熒光定量PCR方法特異性驗(yàn)證

2.5 熒光定量PCR方法的應(yīng)用

在不同的月份，從江蘇省揚(yáng)州市8個(gè)奶牛場(chǎng)中取樣原料乳，提取奶樣DNA，進(jìn)行熒光定量PCR及常規(guī)PCR檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，所有樣品的Ct值均不在檢測(cè)范圍中，說(shuō)明這8個(gè)牧場(chǎng)這三個(gè)月里都沒(méi)有感染S.marcescens。同時(shí)，常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果也未檢出陽(yáng)性樣品。

表2 不同牧場(chǎng)不同月份原料乳中S. marcescens熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究建立了S. marcescensluxS基因的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，通過(guò)此方法，得出了人工污染奶樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-1.864x+31.32，相關(guān)系數(shù)為0.999，菌液濃度為6.9×107～6.9×102cfu/mL，對(duì)應(yīng)的Ct值范圍是16.70～26.02[11]。本研究中熒光定量PCR對(duì)S. marcescens的最低檢測(cè)限是6.9×102cfu/mL，而常規(guī)PCR的檢測(cè)限是6.9×103cfu/mL。李一松等[12]用熒光定量PCR檢測(cè)乳中攜帶sea基因金黃色葡萄球菌，結(jié)果表明，該方法可以快速穩(wěn)定地檢測(cè)出乳中的金黃色葡萄球菌，并確定了有效檢測(cè)限是8.3×102cfu/mL。由此可見(jiàn)，熒光定量PCR方法的檢測(cè)限范圍比常規(guī)PCR要廣。

在采樣的8個(gè)牧場(chǎng)的原料乳中，所有樣品的Ct值均不在檢測(cè)范圍內(nèi)，說(shuō)明這8個(gè)牧場(chǎng)這三個(gè)月的原料乳均未感染S. marcescens?？赡苁且?yàn)檫@三個(gè)采樣月正值冬季氣溫較低，不利于微生物的生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)建立了熒光定量PCR檢測(cè)原料乳中粘質(zhì)沙雷氏菌的方法，方法靈敏度為6.9×102cfu/mL，比常規(guī)PCR方法的靈敏度高，且特異性強(qiáng)。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR不僅完成了PCR從定性到定量的提升，更由于靈敏度高、特異性強(qiáng)而降低了相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)可以快速檢測(cè)原料乳中的S. marcescens，可有效提升原料乳的質(zhì)量安全檢測(cè)水平，促進(jìn)乳制品行業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。